狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）感染引起的一种高致死性人兽共患传染病,目前尚无有效的治疗策略,主要通过狂犬病疫苗免疫诱导机体产生抗病毒中和抗体（VNA）来进行防控。荧光抗体病毒中和试验（FAVN）是由OIE推荐的当前被广泛认可的测定RABV的VNA滴度的方法。FAVN方法的检测过程中需要依赖两个进口试剂,即标准血清和FITC标记的抗RABV-N的荧光抗体（FITC-RABV-N）,而这两个试剂价格昂贵且常出现供应不稳定造成试验无法开展的问题。因此,本研究通过筛选具有中和活性的抗RABV的单克隆抗体替代进口的标准血清,同时通过构建表达e GFP的重组RABV来摆脱对FITC-RABV-N的依赖,既节约了检测成本又缩短了检测时长,使方法得到了优化,具体的结果如下:1.筛选具有中和活性的RABV单克隆抗体替代标准血清G蛋白是RABV病毒粒子仅有的暴露在表面的结构蛋白,同时也是诱导VNA生成的主要抗原。本研究利用纯化的RABV病毒作为免疫原筛选针对G蛋白的MAb。通过杂交瘤细胞的制备及单克隆筛选纯化,利用本实验室之前构建的CDV-RABV-G病毒进行间接免疫荧光（IFA）实验筛选抗原识别RABV-G的单克隆抗体,共筛选出了9株针对G蛋白的MAb,分别命名为1E11、2B10、5E9、6G10、7A3、8A5、9A7、9F7和9F10。通过RABV的体外中和活性检测,我们发现7A3的中和活性最高。将7A3进行2倍倍比稀释,并通过FAVN试验测定7A3在不同稀释度时的VNA滴度,发现7A3的浓度为6.5 ug/m L时,其VNA滴度为0.5 IU/m L,也即在FAVN实验中标准血清的使用浓度,表明7A3在6.5 ug/m L时可替代标准血清作为FAVN实验的参照。2.构建表达e GFP的重组RABV替代FITC-RABV-N在传统的FAVN实验中需要用RABV的CVS-11株与血清样品中和后,再利用FITC-RABV-N来检测未中和的CVS-11,最终通过对比标准血清和待检血清中未中和CVS-11病毒的荧光灶数目来计算出VNA滴度。同样为了解决试剂短缺的问题以及简化FAVN的操作步骤,我们拟通过构建自发荧光的重组RABV来省去对FITC-RABV-N的使用以及简化操作步骤。因此,本研究中首先以CVS-B2c株（与CVS-11同源性大于99.99%）为母本病毒,将e GFP插至其基因组的G和L基因之间,构建了一株表达e GFP的重组病毒r B2c-G/e GFP/L。同时,为了进一步提升e GFP的表达量使其荧光强度更高,我们将e GFP基因的插入位点提前到病毒基因组的N和P基因之间并加入了核定位序列（NLS）,成功拯救了表达NLS-e GFP的重组病毒r B2c-N/NSL-e GFP/P。通过对两个重组病毒进行比较,我们发现r B2c-N/NSLe GFP/P感染细胞后e GFP的m RNA水平更高,表明e GFP的插入位置提前可以提高e GFP的转录。此外,与e GFP荧光分散在细胞质内的r B2c-G/e GFP/L相比,r B2c-N/NSL-e GFP/P通过NLS可使部分e GFP聚集在细胞核内,使其荧光更为集中,荧光亮度更高,更易于观察,提升了FAVN的准确性。总之,本研究通过将G蛋白的中和性单抗7A3代替标准血清以及将r B2c-N/NSLe GFP/P引入到FAVN中,既节约了试验成本又缩短了试验时长,使FAVN方法得到了优化。