目的：探讨兔BMSCs经体外诱导成骨细胞和猪SIS复合构建的组织工程骨膜,在异体体内成骨并修复大段骨缺损的可行性。为组织工程骨的临床应用进一步提供实验室依据。方法：1选取2周龄新西兰大白兔,无菌条件下用注射器冲出下肢股、胫骨骨髓,贴壁筛选法直接培养骨髓间充质干细胞,传代扩增,观察形态：绘制生长曲线,细胞爬片,碱性磷酸酶测定,骨钙素免疫细胞化学染色。2取新鲜健康猪小肠,按照Abraham长道：物理和化学方法脱细胞、脱蛋白和去除浆膜层、肌层,制备脱细胞的小肠粘膜下层,-80℃冻干真空包装后钻60辐照消毒保存备用。3.将培养至第三代的BMSCs,成骨培养基诱导的第三代成骨细胞接种于SIS膜上,复合培养15天后,构建细胞支架复合物,倒置显微镜、扫描电镜观察细胞粘附和增殖情况。4选取2-3月健康新鲜新西兰大白兔四肢骨,按相关文献报道方法：完全清除附着于骨上的软组织和骨膜,PBS反复冲洗,电动工具细密打孔后,用30%双氧水、99%乙醚交替浸泡24h,连续3次,蒸馏水反复漂洗,自然干燥,真空包装后钴60辐照消毒保存备用。5制作兔桡骨骨缺损模型,随机分为六个组,第1组(1—12)号缺损出为单纯人工骨膜,第2组(13—24)号缺损出为单纯人工骨膜加内固定组,第3组(25—36)号缺损出为脱蛋白骨组,第4组(37—48)号缺损出为脱蛋白骨加内固定组,第5组(49—60)号缺损出为脱蛋白骨加人工骨膜组,第6组(61—72)号缺损出为脱蛋白骨加人工骨膜加内固定组。分别于术后2周、4周、8周、12周取材进行大体观察、HE染色组织学观察,并在相同时间点照DR数字X线、CT扫描三维重建,根据成骨速度、长度、宽度、密度等数据信息进行全面的图像分析并作影像学评价。结果：1采用贴壁筛选法直接贴壁培养BMSCs以及多次传代,细胞获得足够增殖,能较好地维持细胞表型,使MSC纯化,分离的细胞形态均一,以成纤维形、梭形多见,镜下见排列成漩涡状、辐射状生长,生长活力强,增殖迅速,倍增时间平均为36h。单层贴壁生长至P3后,成骨诱导剂诱导可定向分化为成骨细胞。细胞生长速度随之减慢,细胞形态也逐渐发生改变,表现为体积变大,以矮方形,短胖梭形为主,出现扁平无规则细胞堆积,细胞表面失去透光性,其表面可见颗粒状物质,为钙盐沉积。2诱导的三代成骨细胞碱性磷酸酶ALP (Gomori钙钻法)染色结果显示,细胞质中呈现有大小不均的黑色颗粒或块状物沉集。钙化结节染色(茜素红法)桔红色块状影集聚现象呈现,中心颜色深于边缘地带,可出现黑色颗粒点。3组织工程骨膜扫描电镜观察扫描电镜观察SIS膜表而粗糙,为排列整齐的编织状胶原纤维,空隙非常多,大小在100—400pm之间,骨髓间充质干细胞和成骨细胞可贴壁并良好生长：复合培养5d,细胞散在材料表面,呈圆形,细胞间无连接。培养10d后,细胞体积增大,基本仍呈圆形,细胞分泌细胞外基质,可形成细胞间连接。培养15d以后细胞层数也逐渐增加,细胞分裂增殖呈三维生长,细胞分泌大量细胞外基质,呈蜂窝状,缝隙逐渐被细胞外基质填塞而变得致密,细胞轮廓不够规则。4DPB人体现察自制DPB呈灰白色,质脆,易裂。厚度和自体骨皮质类似,中空,髓腔内杂质清空。5影像学和组织学检测同一时间点X线片、三维CT重建、组织学观察结果比较,人工骨膜组从成骨速度和新骨密度上均优于未植入人工骨膜组。DPB和内固定能充分展开人工付膜,新生血管数量、成骨数量及质量比较也明显优于单纯人工骨膜组。骨缺损区成骨细胞分裂增殖,肉芽组织中也可见软骨细胞,并且数目很多,岛状生长。纤维性骨痴、软骨骨痴与骨性骨痴依次出现,有时混杂在一起,后期并见桥接骨痴形成。结论：1采用贴壁筛选法直接贴壁培养BMSCs,可使MSC纯化并能多次传代,增殖迅速,不失为获得组织工程骨种子细胞的一种可靠技术：传代培养的骨髓间充质干细胞体外诱导方法简单可靠,操作简单,诱导的成骨细胞即具有成骨细胞特性,增殖分化能力又较高。2SIS是骨组织工程良好的支架材料：物理及生物特性和自体骨膜相近,并和BMSCs及成骨细胞粘附良好，且易于获得，制济简单，疗效显著。3miscs经诱导(成)成骨细胞和猪SIS复合构逑的组织工程骨膜，生物相容性较好，且具有生物活性，在异体体内有成骨能力并具有修复大段骨缺损的可行性，有可能成为理想的组织工程载体材料。