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背景:原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)起病隐匿,恶性程度高,容易复发转移,是我国导致癌症死亡的第二大因素。中医药在提高肝癌防治水平中发挥了重要作用,在癌症中晚期,患者通常表现为阴阳两虚,用温阳散寒法治疗中晚期肝癌收获了不错的临床疗效,但其作用的机制仍不明确。乌头作为温阳散寒代表药物,已有实验研究发现其有很好的抗癌作用,但其作用靶点不明确。本研究课题主要借助动物和细胞实验,探究乌头对肝癌的防治作用,并从影响免疫功能的作用方面探讨可能的作用机制。研究目的:基于中医辨证论治,以肝癌晚期多用到的温阳散寒药物乌头为研究对象,通过体内体外实验,探讨乌头对肝癌的干预作用,并从免疫调节方面初步探讨其抗肝癌的作用机制,以期为温阳散寒法治疗肝癌提供一定的数据支持。研究方法:1.乌头煎剂对皮下瘤模型小鼠肝癌的防治作用:将50只BALB/c小鼠随机分为5组,即空白对照组、模型组、乌头煎剂低剂量组、乌头煎剂中剂量组和乌头煎剂高剂量组。除空白对照组外,其余各组均于左下肢腹股沟处种植H22小鼠肝癌皮下瘤。然后连续灌胃生理盐水和乌头煎剂3周,观察各组小鼠一般生存状况,记录小鼠体重和肿瘤变化,计算小鼠体质量变化和抑瘤率,取肿瘤组织病理切片染色并拍照。再取50只BALB/c小鼠,分组和干预同前,直至小鼠自然死亡,绘制小鼠生存曲线。2.乌头煎剂对皮下瘤肝癌模型小鼠免疫功能的影响:取30只BALB/c小鼠,分组和干预同前,3周后处死小鼠,计算各组小鼠脾指数和胸腺指数,ELISA检测血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表达水平,流式细胞仪检测外周血中B淋巴细胞和T淋巴细胞数量。3.乌头煎剂对皮下瘤肝癌模型小鼠NK细胞的影响:取30只BALB/c小鼠,分组和干预同前,3周后处死小鼠,流式细胞仪检测各组小鼠外周血和脾脏中NK细胞数量,检测脾脏中CD107a表达水平以评价NK细胞杀伤活性,检测小鼠外周血和脾脏中NK细胞受体(NKp46、NKG2D、TIGIT、TACTILE)表达情况。4.乌头对人肝癌细胞株的影响:MTT比色法检测乌头对人肝癌细胞增殖的影响,Annexin V-FIFC/PI双染法检测乌头对人肝癌细胞凋亡的影响,Transwell小室实验检测乌头对人肝癌细胞迁移能力的影响,Western blot检测乌头对人肝癌细胞中MARKs通路相关蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、P38、p-P38等表达的影响。结果:1.乌头煎剂对皮下瘤模型小鼠肝癌的防治作用:乌头煎剂能够改善小鼠一般生存状况,抑制肿瘤生长,延长小鼠生存时间。2.乌头煎剂对皮下瘤肝癌模型小鼠免疫功能的影响:乌头煎剂能够提高小鼠胸腺指数,降低小鼠脾脏指数,促进血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ等免疫因子表达水平,提高小鼠外周血中T淋巴细胞数量。3.乌头煎剂对皮下瘤肝癌模型小鼠NK细胞的影响:乌头煎剂能够提高小鼠外周血和脾脏中NK细胞数量,乌头煎剂能够增强脾脏中NK细胞的杀伤活性,乌头煎剂能够降低肝癌小鼠外周血中NKp46、NKG2D和TIGIT受体的表达,升高肝癌小鼠脾脏中抑制性受体TIGIT和TACTILE的表达。4.乌头对人肝癌细胞株的影响:乌头能够抑制人肝癌细胞株的增殖能力和迁移能力,促进肝癌细胞凋亡,乌头能够下调p-ERK的表达,上调p-JNK和p-P38的表达。结论:1.乌头煎剂对荷瘤小鼠肝癌具有一定的防治作用,调节荷瘤小鼠的免疫功能是其防治作用的机制之一。2.乌头能够抑制人肝癌细胞株的增殖和迁移能力,促进肝癌细胞株的凋亡,其作用可能和ERK、JNK、P38 MARKs信号转导通路有关。