论文部分内容阅读
背景肾癌(Renal cell carcinoma,RCC)是最常见的泌尿系统肿瘤之一,起源于肾皮质,占恶性肾脏疾病的80%至85%,占所有癌症的2%到3%,其发病率呈逐年上升趋势。中晚期肾癌患者预后极差,中位生存期仅为18个月,且对放疗和化疗敏感性较差,易耐药。因此,寻找一种安全、有效、副作用少的生物治疗药物对中晚期肾癌患者的治疗意义重大。“蛋白质组学”最早由Wilkins等人1996年提出,指的是特定组织或器官在规定的时间点和特定的生理(或病理)条件下的蛋白质组成。随着质谱分析技术的不断进步,蛋白质组学研究得到了飞速的发展,同时在癌症的诊断和治疗上进行的研究也不断的深入。蛋白质组学是在蛋白质水平上全面了解疾病发生和细胞代谢的过程。蛋白质组学的研究可以通过质谱分析筛查出不同组织或体液的差异蛋白质谱,进行定性和定量分析,这对寻找肿瘤生物标志物、研究肿瘤的发病机制和寻找新型有效的抗肿瘤药物都具有重要的临床应用价值。本课题组前期将肾母细胞瘤患儿血清与健康儿童血清之间进行对比检测,利用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术筛选出两组中差异明显的蛋白质-M/Z 6455.5Da蛋白,并证实了其在肾母细胞瘤患儿的分期诊断和预后监测的作用,发现了 M/Z 6455.5Da蛋白对肾母细胞瘤体内体外均有抑制作用,这一新发现对今后儿童肾母细胞瘤的诊断和治疗具有重要意义。因此,研究这类安全、有效、副作用少的小分子肽类,可能为中晚期肾癌患者的治疗带来希望,本研究主要利用M/Z 6455.5Da蛋白干预肾癌细胞,从而探讨M/Z 6455.5Da蛋白对于肾癌的影响及作用机制。目的1.研究M/Z 6455.5Da蛋白对人肾癌细胞786-O、ACHN增殖和凋亡的影响。2.探讨M/Z 6455.5Da蛋白诱导人肾癌细胞786-O、ACHN凋亡的分子机制。材料与方法1.材料肾癌细胞:786-O、ACHN,购自中国科学院细胞库。M/Z 6455.5D蛋白:本课题组设计,生产交由LifeTein LLC人工合成(-20℃,避光保存)。2.方法Ⅰ.采用不同浓度的M/Z 6455.5Da蛋白作用于人肾癌细胞786-O、ACHN,细胞增殖毒性试验(Cell CountingKit-8简称CCK-8法)检测M/Z6455.5Da肽段对人肾癌细胞786-O、ACHN的增殖的影响,并且作图描绘细胞生长曲线。使用不同浓度带有FITC荧光素标记的M/Z 6455.5D多肽作用于肾癌细胞786-O、ACHN,采用细胞间接免疫荧光技术来检测多肽与肾癌细胞的结合位点。选取浓度分别为0 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml的M/Z 6455.5Da蛋白干预肾癌细胞,利用流式细胞术来检测细胞的凋亡。Ⅱ.选取浓度分别为 0 mg/ml、0.25 mg/ml、0.75 mg/ml 和 1.25 mg/ml 的 M/Z 6455.5Da蛋白作用于人肾癌细胞786-O、ACHN,通过Western blot检测实验得到Bax、Bcl-2和PCNA蛋白的表达图谱,初步探讨M/Z 6455.5Da蛋白诱导肾癌细胞凋亡的分子机制。结果1.细胞增殖毒性试验(CCK-8)检测结果提示,使用0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mg/ml浓度的M/Z 6455.5Da蛋白处理人肾癌细胞786-O、ACHN(24 h、48 h、72h),在培养时间相同的情况下,人肾癌细胞的生长抑制率随着多肽浓度的增加而快速提高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。在相同多肽浓度下,人肾癌细胞的生长抑制率随着时间的增加而快速提高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明,M/Z 6455.5Da蛋白多肽可显著抑制肾癌的增殖,总体呈浓度-时间依赖效应。细胞免疫荧光实验表明,带有FITC标记的M/Z 6455.5Da蛋白主要作用于肾癌786-O、ACHN细胞的细胞膜或细胞质。在流式细胞术(Annexin V-FITC/PI)检测细胞凋亡实验中,M/Z 6455.5Da蛋白多肽作用于肾癌细胞786-O、ACHN(48 h),与对照组0 mg/ml相比,0.5 mg/ml、1.0mg/ml浓度实验组,随着多肽浓度的升高,细胞凋亡率逐渐升高,差异具有统计学意义(P<0.05),表明M/Z 6455.5Da蛋白能诱导人肾癌细胞的凋亡,并成浓度依赖效应。2.人肾癌细胞 786-O、ACHN 经浓度为 0 mg/ml、0.25 mg/ml、0.75 mg/ml和1.25 mg/ml的M/Z 6455.5Da蛋白干预48h后,利用Western blot实验检测Bax、Bcl-2 和 PCNA 蛋白的表达。结果浓度为 0.25mg/ml、0.75 mg/ml 和 1.25 mg/ml的实验组细胞中的Bcl-2和PCNA蛋白表达明显低于M/Z 6455.5Da蛋白多肽浓度为0 mg/ml的对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。同时,随着M/Z 6455.5Da蛋白多肽浓度的升高,Bcl-2和PCNA蛋白表达逐渐降低,实验组与对照组之间的差异具有统计学意义(p<0.05)。结果表明,M/Z6455.5Da蛋白能够抑制人肾癌细胞Bcl-2和PCNA蛋白的表达,且呈浓度依赖关系。检测还发现各实验组细胞中的Bax蛋白表达高于对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。而且M/Z 6455.5Da蛋白浓度越高,Bax蛋白表达越高,实验组与对照组之间的差异具有统计学意义(p<0.05)。结果表明,M/Z6455.5Da蛋白可以上调Bax蛋白的表达,且呈浓度依赖关系。综上所述,血清标记物M/Z 6455.5Da蛋白质多肽诱导的凋亡可能是由上调Bax蛋白的表达和下调Bcl-2、PCNA蛋白的表达来共同调控发挥作用。结论:1.M/Z 6455.5Da蛋白可以抑制人肾癌细胞786-O、ACHN的增殖并诱导人肾癌细胞凋亡。2.M/Z 6455.5Da蛋白可能通过上调促凋亡蛋白Bax的表达和下调PCNA、Bcl-2蛋白的表达来发挥诱导人肾癌细胞786-O、ACHN凋亡的作用。