随着社会的发展及老龄化程度的增加,许多脑内疾病已成为威胁人类健康的一大问题。许多蛋白多肽类药物具有良好的中枢治疗活性,但由于药物在体内稳定性差以及血脑屏障(BBB)的存在,很大程度上限制了这些药物的脑部递送,因而很难发挥其中枢治疗作用。BBB是存在于血液和脑组织间的一层屏障系统,由极化的脑毛细血管内皮细胞通过复杂的细胞间紧密连接构成,它对于维系脑内环境的相对恒定十分重要,但同时BBB也限制了治疗性药物向脑部的转运,是药物进入脑组织发挥治疗作用的主要屏障。构建新型的具有提高药物脑内递送能力的药物传递系统,已成为药剂学的研究热点。鼻腔嗅粘膜与脑之间存在直接通路,通过鼻腔给药,有望帮助药物绕过BBB,提高其脑内递释,具有很高的研究价值和临床意义。　　 纳米粒(NP)递药系统是将药物包载在生物可降解的高分子材料中,可以有效防止药物在体内的降解,提高药物稳定性,有望增加药物的吸收。然而,普通NP通过鼻腔给药仍存在许多不足:NP粒径较大,很难穿过细胞间紧密连接吸收,透粘膜吸收能力较弱;对鼻粘膜的粘附能力弱,容易在鼻纤毛摆动的影响下被清除,鼻腔中滞留时间不长,影响了NP的摄取量;在鼻粘膜上缺乏部位选择性,无法更有效地将药物转运到与脑有通路的嗅粘膜,因而脑内递药效率差。本课题组高小玲博士构建了一种新型的经鼻给药脑内递药系统-凝集素修饰纳米粒递药系统。以表面修饰麦胚凝集素的NP(WGA-NP)作为药物的载体,在增强药物体内稳定性的同时,还能与鼻腔嗅粘膜上选择性高表达的N-乙酰氨基葡萄糖特异结合,延长递药系统在鼻粘膜上的滞留时间,介导鼻粘膜特别是嗅粘膜对递药系统的吸收,选择性地递送更多的药物入脑。本课题拟采用体外细胞实验及组织切片观察进一步探讨WGA-NP递药系统跨粘膜的机理及经鼻入脑的通路。　　 本文第一部分为WGA-NP的构建与表征。使用香豆素-6(Cou-6)及量子点(QDs)两种不同的荧光染料作为探针,将一定比例的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(MPEG-PLA)和马来酰亚胺聚乙二醇一聚乳酸(MAL-PEG-PLA)经乳化/溶媒蒸发法制备得到NP,该NP表面的马来酰亚胺基与巯基化的WGA通过共价连接,得到WGA-NP。制备条件:MPEG-PLA:MAL-PEG-PLA质量比为9:1;巯基化试剂2-IT:WGA摩尔比为60:1;MAL-PEG-PLA:WGA摩尔比为3:1;反应时间为9h。　　 制备得到NP及WGA-NP大小均匀、形态圆整,平均粒径100nm左右,Zeta电位-20mV左右。通过免疫电镜观察证实WGA-NP表面连接有WGA;通过红细胞凝集试验证实,连接于WGA-NP表面的WGA仍具特异性糖基结合的活性。通过冷冻电镜观察证实每个NP内部均包封有数个荧光探针分子。体外泄漏试验证实Cou-6体外泄漏量小;通过比较QDs和NP-Ods的光稳定性,证实NP的包封可有效提高QDs的光稳定性;通过比较WGA-NP-Cou-6和WGA-NP-QDs的光稳定性,证实QDs荧光寿命更长,光稳定性更好,可作为一种新型荧光探针用于递药系统的示踪。　　 为了考察鼻腔给药是否优于其他常规给药方式,第二部分首先比较了中枢活性药物盐酸美沙酮,三种途径大鼠给药后生物利用度的差别,得到鼻腔给药起效快,生物利用度较高,安全性相对较好的结果。为了评价WGA-NP经鼻给药后能否有效提高药物的入脑量,发挥药物的治疗活性,进一步选用具有促进记忆和智力作用的蛋白多肽药物一血管活性肽(VIP)为模型药物,采用复乳/溶媒蒸发法制备的NP-VIP及WGA-NP-VIP,通过Morris水迷宫实验比较不同给药方案组大鼠间的药效学差别,研究WGA-NP递药系统用于蛋白多肽类药物脑内递送的可行性。采用AF64A侧脑室注射构建大鼠中枢胆碱能神经元损毁AD模型,通过Morris水迷宫实验评价VIP不同制剂对大鼠空间记忆障碍的改善作用。结果证实痴呆模型组大鼠在行为学上表现出明显的空间记忆障碍特征,建模成功;皮下注射及鼻腔给予VIP水溶液,对于改善AF64A侧脑室注射所致大鼠空间记忆障碍无效,结果与痴呆模型组无显著性差异;NP-VIP(25μg/kg)鼻腔给药后,能够对大鼠中枢胆碱能系统发挥一定的保护作用,改善大鼠的空间记忆障碍,说明VIP经NP包载后提高了稳定性和入脑量;WGA-NP-VIP鼻腔给药,在剂量减半(12.5μg/kg)的情况下仍可产生明显的空间记忆改善作用,水迷宫实验结果与正常对照组类似,说明WGA-NP是更有效的脑内递药系统,为具有脑内治疗活性药物,特别是稳定性差、难以通过血脑屏障的蛋白多肽类药物脑内递送提供了有效手段。　　 第三部分为WGA-NP递药系统体外跨细胞转运机理的初步探讨。通过体外细胞培养的方法,成功建立Caco-2细胞单分子层模型,光学显微镜和电镜观察证实经过2l天的培养后,细胞形成了紧密的单分子层结构,并分化出极性上皮细胞特有的微绒毛及细胞间紧密连接结构;跨膜电阻大于400Ω·cm2,转运标准物14C-蔗糖的通透量小于0.5％/h,均符合转运实验的要求。活细胞摄取试验及胞内定位试验证实WGA-NP通过粘附在细胞表面,逐渐被摄取到细胞内部,在胞内的分布呈现一定部位特异性,在高尔基体及溶酶体中均观察到WGA-NP-QDs的荧光点。通过高内涵分析仪定量检测Caco-2细胞对WGA-NP-QDs的摄取,观察到Caco-2细胞对WGA-NP-QDs的摄取量比NP-QDs明显提高;而预先让细胞与各种抑制剂共孵育后,细胞对WGA-NP-QDs的摄取均有所下降,与未加抑制剂的对照组有显著性差异,说明WGA-NP是通过与Caco-2细胞表面N-乙酰氨基葡萄糖特异性结合介导内吞,内吞包括包被凹陷、穴样凹陷两条途径,高尔基体、溶酶体、微管及肌动蛋白均参与细胞摄取过程。通过HPLC检测Caco-2细胞单分子层对WGA-NP-Cou-6的转运,观察到WGA-NP-Cou-6比未修饰的NP-Cou-6透细胞转运量有显著性增加,转运量与溶液浓度呈一定正相关,且存在饱和现象,说明WGA-NP细胞转运机理为Caco-2细胞表面特异受体或载体介导;细胞在37℃环境下对WGA-NP-Cou-6的转运量比4℃有显著性提高,说明递药系统被内化,内吞需要消耗能量;预先将各种抑制剂与细胞共孵育后,细胞对WGA-NP-Cou-6的转运均有所下降,说明高尔基体、溶酶体、细胞内微管及肌动蛋白在药物转运过程中均发挥了很大作用。由此认为WGA-NP跨细胞转运的机理可能是:WGA-NP与N-乙酰氨基葡萄糖特异结合,介导细胞发生包被凹陷及穴样凹陷,在高尔基体、溶酶体、细胞内微管及肌动蛋白等细胞结构参与下转运跨过细胞,整个转运存在浓度饱和,且为能量依赖过程。　　 第四部分进一步探讨了WGA-NP递药系统经鼻给药后入脑的可能通路。通过荧光显微镜观察NP-Cou-6和WGA-NP-Cou-6鼻腔给药后不同时间在鼻粘膜各区域的分布情况,结果显示,给药5min后在鼻腔各区的粘膜下已能观察到WGA-NP的荧光点,说明WGA-NP能够迅速透过粘膜细胞被吸收;NP与WGA-NP在粘膜丰富的区域分布较多,且WGA-NP在粘膜下的分布大于NP,说明NP与WGA-NP均易粘附在鼻粘膜表面,增加递药系统在鼻腔的滞留时间,从而提高药物吸收量,WGA-NP更易被细胞摄取,具有更强的透粘膜能力;在靠近嗅球的筛板处观察到WGA-NP的分布量高于NP,提示WGA-NP更易被摄取进入嗅球。WGA可与N-乙酰氨基葡萄糖特异结合,由于鼻腔嗅粘膜上此糖基数量远大于呼吸粘膜,所以观察到WGA-NP对嗅粘膜具有选择性,而未修饰的NP对嗅粘膜和呼吸粘膜没有选择性。通过免疫荧光法标记细胞间紧密连接特有的Z0-1蛋白和鼻粘膜下神经束发现,绝大多数NP及WGA-NP荧光点与Z0-1蛋白不重合,说明NP、WGA-NP很少通过细胞间途径转运,可能主要通过跨细胞途径吸收;NP及WGA-NP荧光点与神经束有重合,且在粘膜下腺体丰富区域有大片分布,说明NP及WGA-NP的入脑转运与腺体及粘膜下神经束均有关。初步分析认为NP及WGA-NP经鼻入脑的通路可能是:经嗅粘膜上皮细胞或腺体吸收进入粘膜下层,经神经束或神经束周围结缔组织吸收入脑。