CIK(cytokine induced killer)细胞是自体外周血单个细胞在体外经多种细胞因子诱导培养产生的一类免疫杀伤细胞。CIK可以直接杀伤或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性效应(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)起作用,但是CIK细胞本身不产生抗体,其杀伤活性由于缺乏特异性抗体存在受到限制,临床疗效并不显著。特异性抗体由激活后的B淋巴细胞产生,可以通过ADCC、吞噬作用、补体依赖的细胞毒作用(Complement dependent cytotoxicity,CDC)起效应,具有较强的抗肿瘤作用。然而大多数实体瘤内部组织致密且存在淋巴回流障碍,因此血液中的抗体难以进入肿瘤实质,导致目前应用抗体治疗大体积的实体肿瘤的疗效不理想。病毒基因治疗载体可以将外源目的基因(如抗体等其它各种抗肿瘤因子)带入靶细胞并实现其在靶细胞内的表达。本研究通过调整外周血单核淋巴细胞(PBMCs)的分离方法建立了稳定高效分离PBMCs的操作流程,可从50ml外周血分离得到PBMCs108个,提高了从外周血中分离PBMCs的得率。进一步研究通过使用Retronectin等细胞因子及大体积细胞培养袋诱导培养CIK优化了CIK体外诱导培养方法,实现了CIK在体外的大量扩增,可在26天扩增细胞总数至1011个。其次利用实验室已有平台在腺病毒穿梭质粒pDC339和含AAV ITR的腺病毒穿梭质粒pDC659的基础上经过多步酶切连接反应将Avastin全长抗体基因插入质粒pDC759基因组,构建携带Avastin全长抗体基因的腺病毒/腺相关病毒复合病毒载体质粒pDC759-Avastin,通过将pDC759-Avastin与含35型纤毛蛋白的腺病毒骨架质粒共转染293细胞同源重组获得携带Avastin全长抗体基因的腺病毒/腺相关病毒复合病毒Ad/AAV 35-Avastin。该复合病毒结合了腺病毒和腺相关病毒的优势,能够稳定快速长效表达抗体。最后使用本文所构建包装的腺病毒/腺相关病毒复合病毒Ad/AAV 35-Avastin感染CIK细胞,通过ELISA和Western Blot分别检测CIK细胞中抗体Avastin的表达量和性质。不同类型携带绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-EGFP)感染CIK证实Ad35(Ad/AAV 35-Avastin的感染情况与Ad35相同)可以高效感染CIK细胞;ELISA实验显示抗体在CIK中的表达量可以达到(640.26±20.21)ng/ml;Western Blot实验表明CIK细胞中表达的抗体的轻链和重链与商品化的Avastin相同。目前本文已完成整个设计的基础实验,大量后续实验仍有待于进一步完成。