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阿维菌素类药物(Avermectins,AVMs)属于大环内酯类广谱驱虫药物,由于其优良的驱虫活性而广泛应用于养殖业。然而作为高毒性的化合物,其在动物可食性组织中的残留问题令人关注。本研究建立了动物可食性组织中阿维菌素类药物免疫亲和色谱净化和固相萃取前处理技术,并建立了用于AVMs残留检测的液相色谱法(HPLC)和液相色谱串联质谱法(包括IAC-LC-MS/MS和SPE-LC-MS/MS方法),为阿维菌素类药物残留监测提供了常规定量和确证方法。
建立了牛肝脏、牛肌肉和猪肝脏组织中埃普菌素(eprinomectin)、阿维菌素(abamectin)、多拉菌素(doramectin)和伊维菌素(ivermectin)残留的固相萃取净化,HPLC-荧光检测器测定方法。组织样品用乙腈提取,提取液经C18SPE柱净化,再用N-甲基咪唑,三氟乙酸酐,三乙胺和乙酸室温衍生化30min,最后HPLC测定。在5、10和150ng/g的添加水平,在上述组织中各药物的回收率在67.53%-93.65%之间,变异系数在0.86%-16.99%之间。检测限为0.5-1.0ng/g;定量限为1-2ng/g。满足AVMs残留检测的要求。
本文通过对阿维菌素进行结构改造,用混合酸酐法与BSA偶联合成了完全抗原,免疫家兔获得了抗ABM的多克隆抗体。该抗体对阿维菌素类药物的交叉反应:埃普菌素为145.4%、伊维菌素为25.0%、多拉菌素为12.3%。并应用此抗体制备了免疫亲和色谱(Immunoaffinetychromatography,IAC)柱,该IAC柱可同时特异性结合阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃普菌素,动态柱容量分别为3540、3448、3321和3461ng/mLgel,绝对柱容量分别为495、483、465和484ng/mgIgG。IAC柱在一个月的时间内重复使用20次后,上述药物的动态柱容量仍能达到600ng/mLgel。
国内外首次建立了牛肝脏和肌肉组织中埃普菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素残留的IAC-HPLC-MS/MS检测方法。组织样品用甲醇提取,提取液经PBS缓冲液稀释后上IAC柱,用PBS-甲醇和纯水-甲醇溶液淋洗,甲醇洗脱,液相色谱-电喷雾阳离子-串联质谱(LC-ESI+-MS/MS)测定,分别选取m/z为936.6,895.6,921.5和897.5的离子作母离子;m/z为352.0*和490.0,449.3*和327.4,353.2*和449.0,329.1*和753.3的产物离子作质谱检测的确证和定量离子(*为定量离子)。在5、10、20和50ng/g的浓度添加水平,牛肝脏组织中药物的回收率为62.93%-84.03%,变异系数为6.02%-17.39%;牛肌肉组织中药物的回收率为63.25%-86.91%,变异系数为5.61%-15.92%。上述药物的确证检测限为2.5ng/g,定量限为5ng/g。
同时,建立了牛肝脏和肌肉中上述4种药物残留的固相萃取净化-液质联机测定方法,该方法上述药物的回收率、检测限和定量限与IAC-HPLC-MS/MS方法相当。但IAC-HPLC-MS/MS方法更为简单、快捷、方便。
以0.2mg/kg体重的剂量,肉牛颈部皮下注射埃普菌素注射用油剂,用上述建立的SPE-HPLC-MS/MS和IAC-HPLC-MS/MS两种方法检测。统计表明,两种检测方法测定结果无明显差异。