【摘 要】
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第一部分原肌球蛋白调节蛋白1对巨噬细胞黏附和迁移的影响及机制分析动脉粥样硬化是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。巨噬细胞泡沫化后迁移能力的降低是动脉粥样硬化发生中的关键步骤。原肌球蛋白调节蛋白1,是原肌球蛋白的结合蛋白,是F-actin慢生长端的盖帽蛋白,能够稳定原肌球蛋白包被的肌动蛋白丝,决定着细胞的生物力学特性。目的:本实验旨在探讨原肌球蛋白调节蛋白1对巨噬细胞黏附和迁移的影响,并对其分子
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第一部分原肌球蛋白调节蛋白1对巨噬细胞黏附和迁移的影响及机制分析动脉粥样硬化是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。巨噬细胞泡沫化后迁移能力的降低是动脉粥样硬化发生中的关键步骤。原肌球蛋白调节蛋白1,是原肌球蛋白的结合蛋白,是F-actin慢生长端的盖帽蛋白,能够稳定原肌球蛋白包被的肌动蛋白丝,决定着细胞的生物力学特性。目的:本实验旨在探讨原肌球蛋白调节蛋白1对巨噬细胞黏附和迁移的影响,并对其分子机制进行初步探讨。方法:提取野生型小鼠和TOT/Tmod1-/-小鼠的腹腔巨噬细胞;用Tmod1的腺病毒感染Raw264.7细胞以获得过表达Tmod1的巨噬细胞;用氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞成为泡沫细胞,通过实时定量PCR、蛋白质印迹法、免疫荧光、细胞伸展等方法检测Tmod1在泡沫细胞中的表达、Tmod1敲除和过表达对巨噬细胞伸展和粘着斑分子FAK,paxillin和vinculin表达的影响。结果:1.Tmod1在ox-LDL处理的巨噬细胞中表达升高。免疫印记和Realtime PCR的结果显示,在ox-LDL浓度为50μg/ml和100μg/ml时,Raw264.7巨噬细胞中的Tmod1蛋白表达水平和m RNA水平表达相比于0μg/ml是显著升高的（P<0.01）,并且在100μg/ml时Tmod1表达水平是最高的（P<0.01）。2.Tmod1敲除抑制ox-LDL引起的巨噬细胞伸展。Tmod1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞的伸展能力在0.5小时和2小时都要显著低于野生型小鼠的腹腔巨噬细胞伸展（P<0.01）。在0.5小时和2小时,ox-LDL能显著增加野生型小鼠腹腔巨噬细胞的伸展（P<0.01）;在0.5小时,ox-LDL能显著增加Tmod1敲除小鼠腹腔巨噬细胞的伸展（P<0.01）,而在2小时,ox-LDL不能显著增加Tmod1敲除小鼠腹腔巨噬细胞的伸展（P>0.05）。3.Tmod1敲除引起巨噬细胞中粘着斑相关蛋白的表达改变。Tmod1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞中p FAK、p Paxillin和Vinculin的表达水平相比野生型小鼠有明显地升高（P<0.05）;而ox-LDL能显著增加野生型小鼠腹腔巨噬细胞p FAK和p Paxillin的表达（P<0.05）,降低野生型小鼠Vinculin的表达（P<0.05）;ox-LDL对Tmod1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞p FAK、p Paxillin和Vinculin表达的影响未见明显差异（P>0.05）。免疫荧光的结果也显示Tmod1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞中p Paxillin和Vinculin的表达相比野生型小鼠有明显地升高（P<0.05）。4.Tmod1敲除消除了ox-LDL引起的巨噬细胞paxillin的持续激活。蛋白免疫印记的结果显示,ox-LDL可以在野生型小鼠腹腔巨噬细胞中引起Paxillin的持续激活,随着ox-LDL处理时间的增加,p Paxillin的表达是持续升高的,并且在处理48小时仍然是持续升高的;而Tmod1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞p Paxillin的表达水平并没有因为ox-LDL处理时间的增加而增加,差别没有统计学差异。结论:1.Tmod1在ox-LDL处理的巨噬细胞中表达升高。2.Tmod1敲除抑制ox-LDL引起的巨噬细胞伸展。3.Tmod1敲除引起了巨噬细胞中粘着斑相关蛋白的表达改变。4.Tmod1敲除消除了ox-LDL引起的巨噬细胞paxillin的持续激活。第二部分ApoE和Tmod1基因双敲小鼠血液流变学和血脂的变化目的:研究载脂蛋白E（ApoE）和原肌球蛋白调节蛋白1（Tmod1）基因双敲小鼠的血液流变学和血脂的改变。方法:将心脏过表达而全身其他部位敲除Tmod1的小鼠(TOT/Tmod1-/-)与ApoE-/-小鼠杂交获得ApoE和Tmod1的双敲小鼠(ApoE-/-/TOT/Tmod1-/-),并进行基因型鉴定。从ApoE-/-和双敲小鼠取血检测血细胞计数、血液流变学指标和血脂水平。结果:同ApoE-/-小鼠相比,双敲小鼠血细胞计数部分指标有显著性改变（P<0.05）;红细胞的最大变形指数和变形曲线积分面积明显降低（P<0.05）;渗透脆性显著变差（P<0.05）;血脂中甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇有显著升高（P<0.05）。结论:Tmod1的敲除能够引起小鼠红细胞流变学和血脂水平的改变。
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