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哺乳动物卵巢卵母细胞体外发育的研究，最初主要关注出生后卵泡的生长发育与卵母细胞的成熟与受精，而原始卵泡体外形成与发育激活的研究鲜有报道，这使人们对原始卵泡的形成和发育激活的调控机制了解甚少。对于卵泡形成与发育激活的研究来说，真正的挑战是建立原始卵泡的体外形成与发育的技术体系，然后利用卵泡发育的体外模型进行其机制研究。这对于开发卵母细胞资源，促进高产家畜的繁殖潜能挖掘，推迟女性的更年期，治疗卵巢早衰等疾病都至关重要。本实验的目的是借助本实验室建立的原始卵泡体外形成与发育激活的技术平台，探索insulin通过PI3K/Akt信号通路调控生殖细胞Cyst解聚、原始卵泡形成和发育激活的分子机制。
本研究首先检测了小鼠体内原始卵泡形成和发育过程中Akt磷酸化水平的变化。收集13.5dpc、16.5dpc、0dpp、3dpp胎鼠或新生鼠卵巢组织进行kt和pAkt蛋白的WesternBlot检测，结果显示:从13.5dpc到3dpp的小鼠卵巢卵泡发育过程中，pAkt/Akt的比值有显著的提高，特别是在3dpp的小鼠卵巢细胞中pAkt/Akt的比值达到了1.689±0.098％,显著高于16.5dpc胎鼠卵巢卵泡的pAkt/Akt比值0.846±0.102％(P＜0.01)。收集16.5dpc胎鼠卵巢组织体外培养6d，对培养的卵巢组织进行WesternBlot检测，结果发现，Akt的磷酸化水平与体内的变化趋势一致。在16.5dpc胎鼠卵巢培养时，添加0、1、5和10μg/mlinsulin，并且在培养的15、30、45和60min四个时间点收集卵巢样品进行检测，发现5μg/mlinsulin处理组的pAkt/Akt比值极显著高于没有添加insulin的对照组(P＜0.01），并且在15、30、45和60min各时间点都有相同趋势。免疫组化试验和定量PCR实验也证实了添加5μg/mlinsulin培养30min后，InsR的表达量明显增加。另外，培养时添加PI3K的抑制剂LY294002能显著降低5μg/mlinsulin处理的16.5dpc卵巢pAkt/Akt比值。这说明insulin通过InsR影响了PI3K/Akt信号通路。
将16.5dpc卵巢体外培养到3d时，添加5μg/mlinsulin的实验组和对照组在卵泡形成与发育激活方面的差异不大，即实验组与对照组之间，卵母细胞在Cysts、原始卵泡和初级卵泡中的比例差异不大。然而，当将16.5dpc卵巢培养到5d时，卵母细胞在Cysts中的比例，实验组（63.4±8.91％）和对照组（53.13±10.17％）之间有极显著的差异（P＜0.01）。此外，实验组处于初级卵泡阶段的卵母细胞比率为1.76±1.07％，显著小于对照组处于初级卵泡阶段的卵母细胞比率8.33±0.77％(P＜0.05)。这些结果说明，insulin阻碍了卵泡的形成与发育激活，而这个作用途径是通过Insulin-InsR-PI3K-Akt实现的，Akt磷酸化的增强阻碍了卵泡的形成与发育激活。
将3dpp小鼠卵巢体外培养5d，分别添加5μg/ml和10μtg/mlinsulin的试验组卵巢pAkt/Akt分别为0.46±0.047％和0.253±0.051％，与对照组的0.63±0.029％差异显著或极显著(P＜0.05，P＜0.01)。利用组化技术分析了体外培养的卵巢卵泡发育情况，结果显示:3dpp卵巢添加insulin培养5d后，卵泡形成与发育激活都得到了促进，卵母细胞在Cysts中的比率，添加5μg/mlinsulin的实验组为10.28±2.97％，与对照组23.11±10.78％差异极显著(P＜0.01）。卵母细胞在次级卵泡中的比率，实验组为7.23±0.94％，对照组为2.31±0.47％，差异极显著(P＜0.01)。并且，添加insulin使3dpp新生鼠卵巢中Pten基因5‘调控区的DNA甲基化水平升高，使Pten和Foxo3a基因的表达水平降低。这说明，insulin对3dpp新生鼠卵巢卵泡体外发育的促进是通过了Insulin-Pten-PI3K-Akt-Foxo3a的调节途径。
综上所述，insulin对卵泡形成与发育激活的调控是有阶段特异性的。也就是说，insulin对16.5dpc胎鼠卵泡的体外形成与发育是抑制的，对出生后3d的小鼠卵巢卵泡的体外发育是促进的，并且这些作用皆是通过Insulin-PI3K-Akt信号通路进行调节的。