目的:胰腺癌（Pancreatic cancer）是消化系统中恶性程度最高、预后最差的肿瘤之一。胰腺癌的发生被认为是一个多因素多环节的渐进过程,涉及到基因组的改变和表观遗传学的失调。作为表观遗传学的重要组成部分,N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine,m6A）修饰可以影响RNA的转录、剪接、结构变化、定位、核转运、翻译和降解等。m6A修饰是指RNA腺嘌呤上第6位N原子在甲基转移酶的作用下被催化形成的一种甲基化修饰。研究表明,m6A修饰的整体水平及其调控因子常在不同肿瘤中表达失衡,并在肿瘤的形成、增殖、侵袭和转移、放化疗抵抗、复发等过程中发挥重要作用。关于m6A修饰在胰腺癌中的机制研究目前仅有以下报道:m6A修饰可促进致癌micro RNA-25过度成熟,从而抑制富含亮氨酸的重复蛋白磷酸酶2的PH域,进而激活AKT-p70S6K信号通路,引发胰腺癌细胞的恶性表型。而m6A去甲基化酶Alk B同源蛋白5（Alk B homologue 5,ALKBH5）可通过去甲基化lnc RNA KCNK15-AS1的m6A修饰来抑制胰腺癌细胞运动;也可通过降低钟基因1 mRNA的m6A水平,抑制其mRNA降解,从而激活ATM-CHK2-P53/CDC25C信号通路,进而抑制胰腺癌细胞生长;还可通过降低Wnt抑制因子1（Wnt inhibitory factor 1,WIF1）m6A修饰水平,增加其蛋白表达,抑制Wnt信号通路的激活,从而抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并提高其对化疗的敏感性。m6A识别蛋白YTH结构域家族蛋白（YTH domain family protein,YTHDF）2可通过AKT/GSK3β/Cyclin D1通路促进胰腺癌细胞增殖;而敲除YTHDF2又可通过上调YAP表达水平来诱导上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,从而促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭。然而,m6A RNA修饰在胰腺癌中究竟存在何种变化,以及何种关键m6A调控因子导致该变化目前尚不清楚。因而,我们设计并开展了本研究,旨在探讨m6A RNA修饰在胰腺癌中的表达及特异性调控机制,并探讨这一调控网络在胰腺癌恶性生物学行为中如何发挥作用,为胰腺癌的诊疗提供新的潜在生物靶标。材料和方法:1、经中国医科大学附属盛京医院医学伦理委员会批准,本研究收集了胰腺癌组织及相应癌旁组织的16对新鲜标本和50对石蜡包埋标本。所有患者均在我院行手术治疗,标本病理诊断均为胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma,PAAD）。所有新鲜标本均在离体10分钟内置于液氮罐-80℃冻存。患者手术前均未接受过新辅助治疗。手术后对患者进行随访,总生存期定义为从手术日期到死亡日期或随访终点（2020年12月30日）的时间间隔。购买并培养了5种人胰腺癌细胞系和永生化正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7。利用Epi Quik m6A RNA甲基化定量试剂盒检测胰腺癌组织及其相应癌旁组织、胰腺癌细胞系和HPDE6-C7细胞总RNA中m6A RNA修饰的表达水平。2、通过生物信息学分析和实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测10个主要m6A调控因子在胰腺癌组织及其相应癌旁组织、胰腺癌细胞系和HPDE6-C7细胞中的mRNA表达水平,寻找对胰腺癌m6A修饰起关键调控作用的因子,即m6A去甲基化酶脂肪量和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein,FTO）。再通过免疫组化法扩大样本在50对石蜡组织中检测FTO的表达,并分析其表达水平与胰腺癌临床病理学特征的关系,进一步通过Incu Cyte Zoom活细胞成像系统分析、Cell Counting Kit-8（CCK8）细胞增殖、细胞划痕、transwell细胞侵袭等实验检测FTO对胰腺癌细胞恶性生物学行为的影响。3、通过生物信息学分析、构建及转染小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）下调FTO、构建及转染野生型及去甲基化酶失活突变型质粒上调FTO,应用RT-qPCR、Western blotting（WB）及mRNA稳定性等实验寻找FTO在胰腺癌中的下游靶基因。进一步检测靶基因PJA2对胰腺癌细胞恶性生物学行为的影响,并进行挽救实验。4、通过在胰腺癌细胞中转染野生型质粒上调FTO并筛选稳转细胞株、转染si RNA下调PJA2,应用RT-qPCR及WB检测FTO在胰腺癌细胞中的下游相关通路——Wnt信号通路,从而探讨m6A RNA修饰对胰腺癌恶性生物学行为的影响及特异性调控机制。5、统计分析:所有的统计分析均使用Graph Pad Prism 8.0软件进行。根据数据类型使用不同的统计方法。采用Student’s t检验（双侧）分析连续变量;采用Pearson’s和Spearman’s相关性分析检测两个基因表达的相关性;Kaplan-Meier分析和Log-rank检验用于评估患者生存差异。统计数据均为MEAN±SEM,P<0.05为差异有统计学意义。*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001。ns表示无统计学差异。结果:1、m6A RNA修饰在胰腺癌的组织和细胞系中均上调。首先我们发现与对应癌旁组织相比,胰腺癌组织中m6A RNA修饰表达水平明显升高。所有胰腺癌细胞系中m6A RNA修饰的整体表达水平均显著高于HPDE6-C7细胞,且具有统计学意义。2、导致胰腺癌中m6A RNA修饰上调的主要原因是m6A去甲基化酶FTO低表达。2.1为了探明对胰腺癌m6A RNA修饰起关键调控作用的因子,我们在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）及其他公共数据库中通过多种生物信息分析手段系统地分析了20个主要m6A调控基因在PAAD组织中的变化。结果发现与正常胰腺组织相比,PAAD组织中几乎所有m6A调控基因的mRNA表达水平发生改变,且大部分具有统计学意义。更进一步的生存分析发现,m6A调控基因的改变与胰腺癌患者较差的无疾病无进展生存（disease/progression-free survival,DFS/PFS）和总生存（overall survival,OS）显著相关（Log-rank检验,P=0.035和0.007）。2.2接下来,我们检测了10个主要的m6A调控因子在PAAD组织及其对应癌旁组织的16对新鲜标本和5个胰腺癌细胞系及HPDE6-C7细胞中的mRNA表达水平。发现FTO在胰腺癌组织和细胞系中均明显下调。在细胞系中下调FTO后,m6A修饰表达水平明显上调;过表达野生型FTO后,m6A修饰表达水平明显下调。因此我们认为FTO对胰腺癌m6A RNA修饰上调起关键调控作用。我们发现FTO的表达不仅与胰腺癌的分期和淋巴结转移等有关,而且显著影响患者的预后。FTO表达水平越低,患者的总生存时间越短。此外,我们发现下调FTO可显著增强胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而上调野生型FTO可显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3、FTO通过m6A-YTHDF2依赖性方式增强了胰腺癌中praja环指泛素化酶2（praja ring finger ubiquitin ligase 2,PJA2）mRNA的稳定性。3.1为了探讨FTO通过m6A修饰调控胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制,我们通过Linked Omics、UALCAN及c Bio Portal三大生物信息学分析工具寻找在PAAD组织中与FTO共表达的基因,每种分析中分别挑选出与FTO表达呈显著正、负相关的前20个基因,再分别取交集,发现正相关的基因有5个（AKT3、PJA2、PLEKHM3、ZYG11B、WDR47）;负相关的基因有3个（NUDT8、YDJC、RASSF7）。然后在胰腺癌细胞系中干预FTO后行RT-qPCR检测以上8个候选基因的mRNA表达量,结果发现在胰腺癌细胞中,PJA2的mRNA表达水平随FTO表达水平的变化发生一致性改变。因此,我们初步选定PJA2为FTO在胰腺癌中的下游靶基因。3.2另外,在胰腺癌细胞中干扰YTHDF2后,PJA2的mRNA稳定性增加,其mRNA及蛋白表达水平升高;而干扰YTHDF1后,PJA2的mRNA稳定性、mRNA及蛋白表达量未见明显变化。说明PJA2 mRNA的m6A结构主要与m6A识别蛋白YTHDF2结合,从而加速其mRNA的降解,导致PJA2的mRNA及蛋白表达水平降低。4、FTO在胰腺癌中通过去甲基化PJA2 mRNA的m6A修饰调控Wnt信号通路。通过一系列实验,我们发现在胰腺癌细胞中FTO可以通过PJA2抑制Wnt家族蛋白5a（Wnt family member 5a,Wnt5a）、淋巴样增强因子1（lymphoid enhancing factor 1,LEF1）及β-catenin的表达,促进AXIN1及WIF1的表达,促进糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）磷酸化,从而抑制Wnt信号通路的活性。结论:1、m6A RNA修饰在胰腺癌的组织和细胞系中均明显上调,而m6A去甲基化酶FTO低表达是胰腺癌中m6A RNA修饰上调的主要原因。2、FTO低表达水平与胰腺癌患者生存时间短密切相关。干扰FTO的表达可显著促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;过表达野生型FTO可显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的能力。3、在胰腺癌中FTO低表达导致PJA2 m6A修饰水平上调,并通过m6A识别蛋白YTHDF2促进其mRNA降解,最终导致PJA2 mRNA及蛋白表达水平降低,进而激活Wnt信号通路,促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。FTO-m6A-YTHDF2-PJA2-Wnt信号轴在调节胰腺癌恶性生物学行为中发挥重要作用。