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目的:观察外源性脂联素(Adiponectin,APN)预处理是否可以减轻9月龄APP/PS1/tau三转基因阿尔茨海默病模型(triple-transgenic Alzheimer’s disease model,3x Tg-AD)小鼠的条件恐惧记忆、空间学习记忆能力和突触可塑性损伤,延缓脑内相关病理特征的进展,并探讨其发挥神经保护作用的可能靶点和分子机制。同时,检测不同月龄3x Tg-AD小鼠的血清脂联素水平变化特点,探讨其作为AD诊断标志物的可能性。方法:采用9月龄雄性3x Tg-AD小鼠和野生型(wild type,WT)C57BL/6小鼠作为研究对象,随机分为四组:野生型对照组(WT-Saline)、AD模型组(3x Tg-Saline)、野生型给药组(WT-APN)和AD给药组(3x Tg-APN),每组10-17只。各组小鼠分别在自由清醒状态下连续10天经侧脑室慢性注射0.1μg/4μl脂联素或者等体积的生理盐水。10天后开始行为学实验,实验期间持续给药。行为学实验分为两部分:(1)巴恩斯迷宫实验:包括习惯阶段、训练阶段和探索阶段。习惯阶段实验在训练阶段开始前一天进行,提起起始管后在90分贝的蜂鸣声刺激下将小鼠引导至逃生盒并停留1 min,每只小鼠习惯1次。训练阶段共持续6天,每天每只小鼠重复3次,重复间隔15 min。每次实验时小鼠在90分贝的蜂鸣声刺激下自由探索3 min并寻找逃生盒,记录每只小鼠寻找逃生盒的逃避潜伏期。探索阶段去除逃生盒,记录小鼠在声音刺激下在逃生盒所在象限探索时间占探索总时间的百分比及其运动速度。(2)条件恐惧实验:包括训练阶段和测试阶段。在训练阶段,小鼠在条件恐惧箱中自由探索90 s,随后给予30 s声音刺激,声音刺激的最后2 s同步给予持续直流电刺激。联合刺激重复5次,间隔90 s。第5次联合刺激结束90 s后再给予30 s单纯的声音刺激,记录小鼠在自由探索期和第5次联合刺激后声音刺激期的僵直比(僵直时间占该时期总时间的百分比)。测试阶段,将小鼠放入条件恐惧箱中自由探索150 s,随后持续给予150 s声音刺激,记录每只小鼠在自由探索期和声音刺激期的僵直比。行为学实验结束后进行在体电生理记录。小鼠麻醉后固定在脑立体定位仪上,定位海马区并插入绑定的刺激电极和记录电极。首先将刺激电流强度从0开始逐渐增大至0.2 m A,每次增大0.01 m A,记录不同刺激强度下的场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potentials,f EPSPs)的幅度,绘制输入输出曲线(input-output curve,I/O curve)。随后以最大f EPSPs幅度时刺激电流强度的50%作为测试刺激强度记录f EPSPs 30 min,并给予配对脉冲刺激记录双脉冲易化(paired-pulse facilitation,PPF)。最后给予低频刺激(low frequency stimulation,LFS)诱导长时程抑制(long-term depression,LTD),并记录60 min,比较LFS前后f EPSPs斜率的变化情况。在体电生理实验完成后,进行免疫组织化学染色实验。将小鼠麻醉后甲醛固定,断头取脑,脱水后冰冻切片,利用β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)特异性抗体6E10和磷酸化tau蛋白的特异性抗体phospho T231分别孵育脑片,DAB显色,在光学显微镜下观察各组小鼠海马区神经元胞内Aβ沉积和tau蛋白磷酸化水平。对3、6、9、12月龄雄性3x Tg-AD小鼠和WT小鼠采外周血,通过酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测各组小鼠血清脂联素水平。最后,在电生理实验结束后,每组小鼠随机选取3只对海马组织进行第二代基因测序(next generation sequencing,NGS),通过差异基因表达和功能及通路富集分析探寻脂联素发挥神经保护作用的可能靶点和分子机制。结果:(1)脂联素减轻3x Tg-AD小鼠的空间学习记忆能力损伤。巴恩斯迷宫实验训练阶段的第1-6天,各组小鼠的逃避潜伏期均随训练天数增加而逐渐缩短(p<0.05)。同时,3x Tg-Saline组小鼠的逃避潜伏期明显长于WT-Saline组小鼠,脂联素预处理后3x Tg-AD小鼠的逃避潜伏期在第6天明显缩短(p=0.003)。在探索阶段,3x Tg-Saline组小鼠在目标象限所占时间百分比显著低于WT-Saline组(p=0.002),脂联素预处理后3x Tg-AD小鼠在目标象限的探索时间百分比明显增加(p=0.008)。以上结果表明,3x Tg-AD小鼠的空间学习记忆能力受损,而脂联素预处理可以有效减轻这种损伤。(2)脂联素减轻3x Tg-AD小鼠的条件恐惧记忆能力损伤。在训练阶段第5次联合刺激后的声音刺激期,与自由探索期相比,四组小鼠的僵直比均明显增加(p<0.001),且组间无显著差异,表明训练阶段结束时四组小鼠均较好地完成了条件恐惧的学习。在测试阶段的声音刺激期,WT-Saline组(p<0.001)、WT-APN组(p<0.001)组和3x Tg-APN组(p<0.001)小鼠的僵直比与自由探索期相比均明显增高,表明其具有正常的恐惧记忆能力;3x Tg-Saline组小鼠在声音刺激前后僵直比无明显差异(p=0.082),表明其维持恐惧记忆的能力受到损伤。同时,给予声音刺激时3x Tg-Saline组小鼠的僵直比显著低于WT-Saline组(p=0.003),而脂联素预处理后3x Tg-AD小鼠的僵直比明显增高(p=0.013),表明3x Tg-AD小鼠的条件恐惧记忆能力明显受到损伤,脂联素预处理可以减轻这种损伤。(3)脂联素抑制3x Tg-AD小鼠在体海马LTD易化。在体海马场电位记录实验中,四组小鼠的I/O曲线相似,且在同一刺激强度下四组间f EPSPs幅度均无显著性差异(p>0.05);给予测试刺激后30 min内,四组小鼠的f EPSPs斜率均相对稳定且无显著差异(p>0.05),表明APP/PS1/tau基因突变和脂联素预处理均未影响小鼠的基础突触传递功能。给予配对脉冲刺激后,四组小鼠的PPF值(f EPSP2/f EPSP1)组间无显著差异(p>0.05),表明基因型不同以及药物处理均未影响突触前递质释放能力。给予LFS后0 min,四组的f EPSPs斜率均明显降低,表明各组小鼠均成功诱导出LTD。LFS后30 min,3x Tg-Saline组的f EPSPs斜率较WT-Saline组显著降低(p=0.008),脂联素预处理后3x Tg-AD小鼠的f EPSPs斜率明显升高,但与3x Tg-Saline组之间无统计学差异(p=0.05)。LFS后60 min,与WT-Saline组相比,3x Tg-Saline组的f EPSPs斜率仍显著降低(p<0.001),且脂联素预处理后3x Tg-AD小鼠的f EPSPs斜率明显升高(p=0.003)。以上结果表明,3x Tg-AD小鼠比WT小鼠更易维持LTD状态,APP/PS1/tau基因突变对于LTD的维持有易化作用,而给予脂联素处理之后3x Tg-AD小鼠LTD的维持时间缩短。(4)脂联素减轻3x Tg-AD小鼠海马区神经元胞内Aβ沉积和tau蛋白过度磷酸化。3x Tg-Saline组小鼠的海马区神经元胞内Aβ免疫阳性面积(p=0.003)和磷酸化tau蛋白免疫阳性面积(p=0.014)均明显高于WT-Saline组。脂联素预处理后,3x Tg-AD小鼠海马区神经元胞内Aβ沉积明显减少(p=0.044),磷酸化tau蛋白免疫阳性面积明显降低(p=0.037),提示脂联素预处理能够有效减少3x Tg-AD小鼠海马区胞内Aβ沉积和tau蛋白的过度磷酸化。(5)3xTg-AD小鼠血清脂联素水平随病程进展逐渐下降。WT小鼠和3xTg-AD小鼠的血清脂联素水平均表现出随月龄增加先升高再降低的特点,在6月龄时血清脂联素水平最高,之后两种小鼠的血清脂联素水平均呈随月龄增加逐渐下降的趋势。同时,3月龄3x Tg-AD小鼠和WT小鼠血清脂联素水平基本一致(p=0.466),但在6月龄(p<0.001)、9月龄(p<0.001)和12月龄(p=0.031)时,3x Tg-AD小鼠血清脂联素水平均明显低于同月龄WT小鼠。以上结果表明血清脂联素水平随AD的病程进展逐渐下降,且在AD早期就已开始降低,脂联素可能是判断AD病程进展的重要外周标志物。(6)脂联素预处理影响3x Tg-AD小鼠海马组织m RNA转录表达。通过数据质控、基因比对分析和样本间基因表达水平相关性检测,证实样本测序数据质量可靠,所有样本总体基因表达量分布相近且生物学重复可信度高。对脂联素预处理前后3x Tg-AD小鼠海马组织进行差异性基因表达分析,结果显示有33个基因表达水平显著上调,381个基因表达水平明显下调。根据GO富集结果,差异基因的功能多集中在免疫应答和防御反应方向。而KEGG富集结果显示脂联素的神经保护作用可能通过NOD受体、NF-κB、细胞因子与受体的相互作用、TNF及抗原加工和呈递等相关信号通路实现。结论:(1)外源性脂联素预处理可以明显减轻9月龄3x Tg-AD小鼠的空间学习记忆和条件恐惧记忆损伤,抑制其在体海马LTD易化。(2)脂联素能够减轻3x Tg-AD小鼠脑内Aβ沉积和tau蛋白过度磷酸化,通过延缓脑内病理特征的发展起到改善其认知功能和突触可塑性损伤的神经保护作用。(3)脂联素在AD病程中的神经保护作用可能是通过影响NOD受体、NF-κB、TNF等信号通路实现的。(4)3x Tg-AD小鼠血清脂联素水平在AD早期就已开始降低,并且随AD的病程进展逐渐下降,可能是判断AD病程进展的重要外周标志物。