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研究背景:乳腺癌是女性肿瘤患者中已得到人们共识的最常见的恶性肿瘤。是女性人群与癌症相关性死亡的主要原因。长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lnc RNAs)已被证实在乳腺癌的发生发展中扮演着重要角色,但对于绝大多数lnc RNAs在乳腺癌中的具体作用机制仍所知甚少。越来越多的证据显示,许多lnc RNA转录本可以通过竞争性结合micro RNA(mi RNA),来发挥竞争性内源性RNA(endogenous RNAs,ce RNAs)的功能。在本研究中,核仁小RNA宿主基因5(small nucleolar RNA host gene 5,SNHG5)是lnc RNA的成员之一。它最早在B细胞淋巴瘤的研究中被提及,定位于染色体转运蛋白的breakpoint。SNHG5也被认为是多种癌症发展和进展的潜在致癌因素,包括结肠直肠癌、胃癌和肝细胞癌等。然而,SNHG5在乳腺癌中的作用和机制尚未阐明。研究目的:本研究旨在揭示SNHG5在乳腺癌发生发展中的具体作用机制,为乳腺癌的治疗提供新策略,为乳腺癌的预后提供新的预测指标。研究方法:1.使用siRNA在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中构建SNHG5降表达细胞系。细胞功能学实验及细胞凋亡分析确定下调SNHG5后乳腺癌细胞在增殖及细胞周期方面的变化。2.构建SNHG5过表达质粒,稳转入T47D细胞。细胞功能学实验确定SNHG5过表达后乳腺癌细胞在增殖方面的变化。小鼠成瘤实验及免疫组化技术确认SNHG5过表达后肿瘤变化,并检测增殖指标Ki-67的变化。3.细胞同步化。流式细胞术分析降低MDA-MB-231中SNHG5表达水平后细胞周期的分布特点。用western blot检测同步后Cyclin B1及Cyclin D1的表达水平。4.双荧光素酶及RIP确定mi R-154-5p与SNHG5之间的相互作用。RT-q PCR检测SNHG5缺失的MDA-MB-231细胞中mi R-154-5p的表达,及上调SNHG5的T47D细胞中mi R-154-5p的表达。对T47D-SNHG5细胞行mi R-154-5p mimic瞬时转染,使用细胞功能学实验检测mi R-154-5p对细胞增殖的影响及SNHG5与mi R-154-5p的相互作用关系。5.软件预测mi R-154-5p的靶基因增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)。双荧光素酶验证mi R-154-5p与靶基因的关系。RT-q PCR检测对比mi R-154-5p和PCNA在mi R-154-5p过表达MDA-MB-231和对照组中的表达。同方法对比mi R-154-5p和PCNA在mi R-154-5p低表达的T47D和对照组中的表达。Western blotting检测细胞中mi R-154-5p和PCNA的表达水平6.RT-qPCR技术检测T47D-SNHG5、T47D-SNHG5-siPCNA、control三组的SNHG5表达水平。Western blot检测三组中PCNA、Cyclin D1、p16的表达。细胞功能学实验明确细胞的生长抑制作用。流式细胞术分析三组细胞周期分布。免疫组化染色检测PCNA在T47D-SNHG5及T47D-control两组异种移植肿瘤中的表达。7.RT-qPCR检测原发乳腺癌组织及癌旁正常组织中SNHG5及miR-154-5p的表达。KM-plotter进行生存分析。RT-q PCR检测SNHG5与mi R-154-5p表达的关系。研究结果:1.SNHG5与乳腺癌相关,在各细胞系中均表达,与乳腺癌不同分子分型细胞的恶性程度呈正相关;体外实验中,SNHG5缺失可以抑制乳腺癌细胞的增殖,促进凋亡。2.体外实验中,过表达SNHG5可促进乳腺癌细胞增殖;体内实验中,过表达SNHG5的小鼠种植肿瘤,其体积及重量均升高。3.细胞周期方面,SNHG5可促进乳腺癌细胞从G1期向S期的转化,增加S期细胞所占比例,促进细胞增殖。4.SNHG5属于细胞质lnc RNA。预测发现mi R-154-5p与SNHG5具结合可能性。SNHG5的表达水平与mi R-154-5p呈负相关。过表达mi R-154-5p可降低乳腺癌细胞的增殖能力。SNHG5促增殖的机制依赖于对mi R-154-5p的作用。5.PCNA是miR-154-5p的直接作用靶点。6.SNHG5通过对PCNA的调节作用促进乳腺癌细胞增殖,PCNA的缺失可逆转SNHG5对细胞的促增值影响。SNHG5通过对PCNA的调节作用促进乳腺癌细胞的增殖能力。SNHG5-mi R-154-5p-PCNA轴在乳腺癌的增殖中发挥着重要作用。7.SNHG5在乳腺癌肿瘤组织中表达水平升高;mi R-154-5p在乳腺癌肿瘤组织中表达水平降低;SNHG5高表达的乳腺癌患者预后更差;mi R-154-5p高表达的乳腺癌患者预后更为良好;mi R-154-5p的表达水平与SNHG5的表达水平有显著相关性。研究结论:本研究显示,SNHG5在体内及体外实验中均显示出促进乳腺癌增殖的活性。SNHG5的耗竭显著导致细胞周期阻滞在G1期。SNHG5作为mi R-154-5p的招募“海绵”,降低了mi R-154-5p对PCNA的抑制作用。SNHG5通过上调PCNA表达来促进乳腺癌细胞的增殖及细胞周期进程。在临床中样本,SNHG5在乳腺癌中的表达升高,而mi R-154-5p在乳腺癌组织中的表达水平与相邻正常乳腺组织相比降低,两者呈显著负相关。综上所述,我们的研究数据揭示了SNHG5-mi R-154-5p-PCNA轴,并提供了一种解释乳腺癌增殖的新机制。