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目的:获得转录因子DEAF1稳定高表达的293T细胞株,通过免疫共沉淀(Co-IP)和质谱分析技术筛选能与DEAF1相互作用的蛋白质因子,以阐明 DEAF1在淋巴结中调控外周组织抗原基因表达的分子机制及外周免疫耐受建立、维持的机制,为1型糖尿病早期干预和治疗提供新策略。 方法:(1)用TurboFect转染试剂将质粒pEGFP-mDEAF1和pEGFP-N1分别转染293T和2F-2B细胞株,经24小时后,通过荧光显微镜观察DEAF1在2种细胞中的定位。(2)用TurboFect转染试剂将质粒p3×FLAG-mDEAF1分别转染293T和2F-2B细胞株,同时设置相应未转染的空白对照组,经24小时后,通过RT-PCR法和Real-time PCR法检测DEAF1在2种细胞中mRNA表达水平,通过Western blot法检测DEAF1在2种细胞中蛋白表达水平。(3)用TurboFect转染试剂将p3×FLAG-mDEAF1质粒转染293T细胞,经48小时后,用1000μg/ml的G418筛选阳性克隆,挑取单个阳性克隆扩大培养,用Western blot、免疫荧光和FCM检测鉴定DEAF1稳定表达的293T细胞株(293T-DEAF1)。(4)抽提293T-DEAF1和正常293T细胞的核蛋白,用EZviewTM Red ANTI-FLAG M2亲和珠子进行Co-IP,SDS-PAGE分离,挑选明显富集和对照泳道没有的条带做质谱分析,明确DEAF1的相关功能蛋白。 结果:(1)荧光显微镜下可见DEAF1定位于细胞核。(2) RT-PCR、Real-time PCR检测转染组DEAF1的mRNA表达水平明显高于未转染组,分别为P<0.05和P<0.01,差异具有统计学意义;Western blot法检测转染组有融合蛋白mDEAF1/FLAG表达。(3)成功获得稳定高表达DEAF1的293T细胞株。(4)经Co-IP筛选和质谱分析得到一些DEAF1的相关功能蛋白。 结论:成功获得稳定高表达DEAF1的293T细胞株,经Co-IP筛选和质谱分析获得了一些DEAF1相关的功能蛋白,为阐明DEAF1调控外周组织抗原表达的分子机制及外周免疫耐受建立、维持的机制奠定了重要的实验基础。