研究背景和目的在中国，脑血管疾病(cerebral vascular diseases,CVD)在死亡原因中占据第三位，在血管性疾病致死的原因中占据首位。其中缺血性脑血管病(ischemic cerebralvaseular disease,ICD)占据所有脑血管病的70%左右，而在欧美国家则高达85%。目前治疗ICD唯一有效并得到认可的的方法为发病急性期6小时内进行溶栓治疗，除此之外没有其它有效的治疗措施。最近十年干细胞移植治疗缺血性脑卒中的实验研究所取得成果及进展令人鼓舞。骨髓单核细胞(bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)取材容易、提取时间很短（1.5-3小时）、不需要培养、能够自体抑制、没有道德伦理学争议。上述这些优点使得BMMNCs成为干细胞移植战略研究中非常有潜力的移植细胞，也使之成为移植治疗缺血性脑卒中较佳的种子细胞。BMMNCs移植治疗缺血性脑卒中的机制尚不清楚,目前更多的研究结果支持其是通过分泌一系列营养因子而促进神经修复。基于这个理论假设，具有较强分泌营养因子能力的BMMNCs可以认为是目前最佳的治疗缺血性脑卒中的种子细胞。我们在前期研究中首次发现与普通的BMMNCs相比，骨髓抑制-再生的单核细胞（bone marrow regenerative mononuclear cells，BMRMNCs）具有更强的分泌营养因子的能力（如bFGF、NGF、BDNF、VEGF等），故我们推测其移植后能够迁移到缺血区并通过分泌营养因子促进血管再生、抑制细胞凋亡和炎性反应而促进神经功能恢复。为证实这一推测，本研究建立局灶性脑缺血模型并移植BMRMNCs，从细胞-功能-整体三个层次，移植前后分别观测BMRMNCs在体外和模型缺血区分泌营养因子的情况，及探索这些营养因子对缺血区细胞凋亡、炎症反应、血管再生的影响，从而证实BMRMNCs与一般的BMMNCs相比具有更强的分泌营养因子的能力，为临床治疗缺血性脑卒中提供最佳种子细胞。研究内容和方法通过建立大鼠骨髓抑制-再生模型获得BMRMNCs；通过改良大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型制作方法获得更加稳定的局灶性脑缺血再灌注模型；经静脉移植BMRMNCs入局灶性脑缺血再灌注模型大鼠后观察BMRMNCs的疗效。课题研究共分为五部分:第一部分：通过一次性尾静脉注射5-氟脲嘧啶（150mg/kg）建立大鼠骨髓抑制-再生模型并动态观察骨髓变化情况。第二部分：对传统MCAO模型制作方法进行改良，以获得更稳定更可靠的局灶性脑缺血再灌注损伤模型。第三部分：通过对BMRMNCs体外营养因子分泌情况及细胞成分的检测以了解BMRMNCs生物学功能。第四部分：通过对静脉移植后BMRMNCs的跟踪了解其能否迁移到缺血区以及其趋化、迁移的机制。第五部分：BMRMNCs经静脉移植入MCAO大鼠后，检测其在模型缺血区分泌营养因子的情况，并观察这些营养因子对缺血区细胞凋亡、炎症反应、血管再生的影响以进一步探索BMRMNCs治疗缺血性脑卒中的机制。研究结果1．5-Fu注射后大鼠外周血白细胞、血小板计数及骨髓细胞计数均急剧下降,于第7d下降到最低点后逐步恢复并于第14d恢复到正常水平，上述改变符合经典的骨髓抑制-再生过程，提示骨髓抑制-再生模型制作成功。2．对大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型制作方法进行改良，显著提高了模型脑梗死体积和神经功能学评分的稳定性，增加了实验数据的可靠性，为后续实验提供一个标准化的平台。3．BMRMNCs体外分泌VEGF、bFGF、BDNF、NGF的水平明显提高，而且其细胞中CD34+、CD45+、CD90+细胞含量增多，提示其各种干细胞的含量增多。4．静脉移植后与BMMNCs相比，有更多的BMRMNCs迁移到缺血区并存活。BMRMNCs迁移能力的增强可能与其表达的趋化因子SDF-1的受体CXCR4增多相关。5．与BMMNCs相比，BMRMNCs对MCAO大鼠有更好的治疗效果。BMRMNCs移植后通过检测发现：缺血区分泌的营养因子及微血管数目明显增多，而凋亡细胞和炎性因子明显减少，移植的细胞只有很小的比率转分化为神经细胞及神经胶质细胞。这提示BMRMNCs不是通过细胞替代而是通过分泌营养因子进一步抑制缺血区细胞凋亡和炎性反应并促进血管再生而发挥治疗作用。结论与BMMNCs相比，BMRMNCs在体外具有更强的营养因子分泌能力和趋化迁移到病灶的能力。经静脉移植后BMRMNCs能迁移到宿主脑内缺血区并分泌较高水平的营养因子，能减少半暗带区细胞凋亡、促进半暗带区血管再生、减少半暗带区炎症反应、减少脑梗死体积并促进行为学的恢复，其治疗效果优于普通的BMMNCs。BMRMNCs可作为临床治疗缺血性脑卒中较佳的种子细胞。