【目的】真实准确地评估胰岛素敏感性,对于糖代谢调节机制的研究以及胰岛素增敏药物的研发具有重要意义。本课题拟在大鼠和小鼠上建立整体水平评价胰岛素敏感性的主要方法,特别是难度较大的评价胰岛素敏感性的金标准“高胰岛素-正葡萄糖钳夹法”,并形成一系列标准操作规程。在此基础上,应用已建立的各种方法系统考察磷酸腺苷激活的蛋白激酶α2催化亚单位(Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase Catalytic Subunitα2, AMPKα2)基因敲除小鼠的胰岛素敏感性。最后,评价新靶点药物尼古丁乙酰胆碱α7受体, (α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 nAChR)特异性激动剂PNU-282987长期治疗对胰岛素敏感性的改善作用。【方法】第一部分:胰岛素敏感性评价方法的建立。首先,分别考察麻醉剂量、导管留置位置、插管的长度、深度等条件以确定麻醉大鼠和小鼠高胰岛素-正葡萄糖钳夹法的最佳实验方案。然后,又通过比较插管术后导管的固定方法和术后恢复不同时间对钳夹实验结果的影响以确定清醒大鼠高胰岛素-正葡萄糖钳夹法的最佳实验方案。最后,完善本课题组前期建立的胰岛素耐量实验、糖耐量实验、血糖和胰岛素测定等实验方法,并撰写相关标准操作规程。第二部分:胰岛素敏感性评价方法在药物研究中的应用。首先,用已建立的胰岛素耐量实验、葡萄糖耐量实验、HOMA-IR、高胰岛素-正葡萄糖钳夹等方法对AMPKα2基因敲除小鼠和野生型小鼠的胰岛素敏感性进行全面评价。接着,考察α7 nAChR受体特异激动剂PNU-282987长期治疗对胰岛素抵抗的改善作用。将AMPKα2基因敲除小鼠分为两组,分别腹腔注射生理盐水和PNU-282987 (0.53mg/kg),每天一次,连续治疗6周,通过检测上述指标考察胰岛素敏感性变化。【结果】第一部分:胰岛素敏感性评价方法的建立。1.确定了麻醉大鼠、小鼠和清醒大鼠高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验的最佳方案。实验显示麻醉Sprague Dawley(SD)大鼠的平均葡萄糖输入速度(GIR)为26.9±2.5mg/(kg·min),清醒SD大鼠的为29.4±0.8mg/(kg·min),麻醉C57BL/6J (C57)小鼠的为82.6±9.2mg/(kg·min)。2.完成麻醉大鼠、小鼠和清醒大鼠高胰岛素-正葡萄糖钳夹标准操作规程的撰写;完成大鼠和小鼠的胰岛素耐量实验、葡萄糖耐量实验等其它相关方法标准操作规程的撰写。第二部分:胰岛素敏感性评价方法在药物研究中的应用。1. AMPKα2基因敲除小鼠与野生型的HOMA-IR值无明显差异。胰岛素耐量实验显示,在给予胰岛素后30分钟和45分钟时,AMPKα2基因敲除小鼠的血糖下降幅度显著小于野生型。口服糖耐量实验显示,在给予葡萄糖后60分钟和90分钟时,AMPKα2基因敲除小鼠的血糖显著高于野生型。同时,在糖负荷后30分钟和60分钟时间点上,AMPKα2基因敲除小鼠的胰岛素浓度显著低于野生型。高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验显示,AMPKα2基因敲除小鼠GIR为55.8±5.4mg/(kg·min),野生型的GIR= 82.6±9.2 mg/(kg·min),它们之间的差异显著。2.经过6周治疗后,PNU-282987显著改善AMPKα2基因敲除小鼠的HOMA-IR指数。胰岛素糖耐量实验显示,与生理盐水治疗组相比,PNU-282987治疗组在15,30,45分钟血糖降低幅度更大。葡萄糖耐量实验显示,在糖负荷后的0,30,60,90分钟时,PNU-282987治疗组血糖显著低于生理盐水治疗组,而两组胰岛素水平始终无显著差异。【结论】1.本课题在麻醉大鼠、小鼠和清醒大鼠上成功建立了评价胰岛素敏感性金标准方法“高胰岛素-正葡萄糖钳夹法”。2.本室引进的AMPKα2基因敲除小鼠具有显著胰岛素抵抗,葡萄糖耐量降低,同时葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力减弱的特点。3.α7 nAChR受体特异性激动剂PNU-282987长期治疗可以显著改善AMPKα2基因敲除小鼠的胰岛素敏感性,提示α7 nAChR受体可独立介导胰岛素增敏作用,且该作用与AMPKα2无关。