矿物资源是不可再生能源,最近一二百年的疯狂开采和消耗使得能源危机这一问题逐步受到重视,随之产生的环境恶化问题也越来越严重。探寻一种绿色可再生能源来减少或替代对化石燃料的依赖,可以很好的解决这一问题。生物质材料在自然界普遍存在并且具有可再生性,利用微生物分泌的木质纤维素降解酶系将木质纤维素类生物质转化为液体燃料和高附加值的化学品,可以有效的改善环境和缓解能源危机。草酸青霉能分泌完整的纤维素酶系,并且具有较高的半纤维素酶活力,这些特点更有利于木质纤维素的降解。但是纤维素酶的表达水平较低,使得其并没有得到广泛的应用,因此,如何对草酸青霉的纤维素酶表达体系进行系统改造进而提高其产酶的表达效能是当前面临的主要问题。所以,对纤维素酶系改造具有重要应用意义。根据草酸青霉的全基因组序列信息和转录谱数据,我们分析草酸青霉中可能存在11个不同的β-葡萄糖苷酶基因,其中包括6个胞内酶。由于这些β-葡萄糖苷酶的酶学性质各不相同,导致产生的纤维寡糖和单糖的种类不同,因此,对其它纤维素酶的表达调控产生不同的影响,并且在木质纤维素底物的降解体系中发挥着不同的作用。我们对草酸青霉的β-葡萄糖苷酶分别过表达,分析他们对草酸青霉分泌纤维素酶系的影响,筛选对纤维素酶分泌最具有促进作用的基因,从而为草酸青霉的纤维素酶表达体系系统改造提供新的靶点。由于以草酸青霉114-2为原始菌株构建的高产纤维素酶菌株,其分泌的β-葡萄糖苷酶相比外切、内切纤维素酶其酶活比例相对偏低,而在这些突变株中,进一步过表达β-葡萄糖苷酶有可能会对其高产纤维素酶的活性造成不利影响。因此,我们设想另构建一株高产β-葡萄糖苷酶的菌株,并根据特定的降解底物以及所需的多种纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的配比,添加到高产菌株分泌的纤维素酶系中进行配比,以弥补其β-葡萄糖苷酶组分的不足,从而优化生物质的降解酶系结构,提高木质纤维素的糖化效率。由于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因bgl1具有较高的比活力,因此,我们在草酸青霉高产纤维素酶的菌株中,过表达黑曲霉bgll基因,构建β-葡萄糖苷酶高活性菌株,从而改善木质纤维素酶降解体系。草酸青霉JU-A10-S和JU-A10-T是我们实验室经诱变筛选的木质纤维素酶高产突变株,然而它们产纤维素酶的性能相差比较明显。JU-A10-S和JU-A10-T突变株的全基因组已被测序,并进行了生物信息学的比对分析,发现JU-A10-S和JU-A10-T基因组序列之间存在多个位点的突变。因此,我们推测,它们之间的产酶性能差异,很可能与这些突变位点有直接的关系。为解析JU-A10-T相比JU-A10-S高产纤维素酶这一重要性能,以及期望发现未知的纤维素酶表达调控的因素及功能单元,我们基于这两株突变株的基因组SNP位点分析,在草酸青霉野生菌株中分别将包含这些SNP位点的基因组特定序列进行敲除,以分析这些SNP位点与纤维素酶表达调控之间的关系,进而丰富纤维素酶高产菌株的改造所需的靶点。本论文的主要研究结果如下：一、草酸青霉β-葡萄糖苷酶的同源过表达草酸青霉分泌的纤维素酶系可以有效的降解木质纤维素,并且与其它纤维素降解真菌相比具有独特优势,例如酶系比较完整,半纤维素酶活力较高等。根据草酸青霉的全基因组序列信息,我们分析草酸青霉中可能存在11个不同的β-葡萄糖苷酶基因。为阐释这11个β-葡萄糖苷酶基因对草酸青霉纤维素降解效能的影响,我们拟对这些β-葡萄糖苷酶基因分别在草酸青霉野生菌株114-2中过表达。对这些过表达菌株的产酶性能分析发现,在发酵第三天,CBGL1和CBGL4和CBG5的滤纸酶活高于野生菌株,其中过表达bgl4转化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高,但是相比出发菌株,其它突变株的滤纸酶活均有不同程度的降低,其中CBGL2降低的最为明显。发酵第四天,CBG5的滤纸酶活与野生菌株基本持平,CBGL1、CBGL4滤纸酶活依然有所提高,而CBGL2的滤纸酶活却依旧大幅降低。以上研究结果表明,不同β-葡萄糖苷酶基因的过表达对纤维素酶的整体表达具有不同的影响,因此,它们在草酸青霉的纤维素酶系中发挥着不同的作用。二、黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因bgll在草酸青霉中的过表达本实验室自有的纤维素酶高产菌株RE-10,蛋白分泌强度以及纤维素酶的表达水平较出发菌株均有大幅度提高,但β-葡萄糖苷酶的表达相对较低。虽然在这些高产菌株中可以通过过表达β-葡萄糖苷酶基因的方式解决这一问题,但较强的β-葡萄糖苷酶表达活性有可能对其它纤维素酶的表达造成不利影响。根据我们之前的实验结果,在这些高产菌株的发酵液中添加p-葡萄糖苷酶可以显著提高纤维素酶的转化效率。同时,考虑到来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶具有较高的比活力,因此,我们以草酸青霉cbhl的启动子作为过表达盒的启动子,在草酸青霉高产纤维素酶菌株4-1中过表达黑曲霉bgll,得到了一株高产β-葡萄糖苷酶菌株B16。B16突变株在发酵第五天后β-葡萄糖苷酶活力达到170IU/ml左右。在高产菌株的发酵液中以FPA：BG为1：3的比例添加β-葡萄糖苷酶酶的粗酶液时(B16号突变株的发酵液),可以将纤维素的转化率提高50%左右。三、突变株JU-A10-S与JU-A10-T基因组SNP位点的分析及纤维素酶表达新调控因素的挖掘JU-A1O-S与JU-A10-T是实验室诱变筛选到的高产纤维素酶突变菌株。对其基因组序列比对分析发现,JU-A10-S与JU-A10-T的基因组序列不存在大片段DNA的差异,然而它们的产纤维素酶的性能有近两倍差距。为解析JU-A10-T相比JU-A10-S高产纤维素酶这一重要性能,以及期望发现未知的纤维素酶表达调控的因素及功能单元,我们将这些位点在草酸青霉野生菌株中分别进行了敲除。对这些SNP位点缺失突变株酶活测定结果发现,敲除位于第6号染色体上的其中一个SNP位点所在的A区域后,突变株的纤维素酶活提升了2.2倍,然而β-葡萄糖苷酶活力为出发菌株的20%。在不同的碳源下,A突变株的淀粉酶活力相差很大,当以1%微晶纤维素作为唯一碳源时,几乎检测不到淀粉酶活力；当以淀粉作为唯一碳源时,A突变株的淀粉酶活仅为出发菌株的50%；然而在含有麸皮和微晶纤维素的的诱导产纤维素酶培养基中培养时,A突变株的淀粉酶反而超过了出发菌株。荧光定量结果显示,在1%纤维素诱导条件下,A区域敲除后,草酸青霉纤维素酶核心转录因子CreA和AmyR的转录水平明显下调,XlnR的转录水平则上调明显,并且难以检测到淀粉酶编码基因15A和胞外最主要β-葡萄糖苷酶基因bgl1的转录。以上结果表明,SNP位点所在的A区域可能与这些转录调控因子的上游调控信号有关。A区域在114-2的基因组上为多重复非编码区序列,并且这些重复序列成簇分布在草酸青霉的每条染色体上,因此,这种序列的特殊分布很可能与纤维素酶相关基因的表达调控密切相关。