研究背景：　　肺高压（PH）是一种危及生命的疾病，也是导致右心衰竭发生的一个常见的原因。然而，目前我们治疗PH的方法却比较少。流行病学证据表明PH的患病率大约为12-50／1，000，000人。1-磷酸鞘氨醇（S1P）是一种具有生物活性的神经鞘脂代谢物，最近的研究表明，S1P在治疗包括癌症、动脉粥样硬化、糖尿病和骨质疏松症等多种疾病地过程中发挥着重要作用。在哺乳动物中，S1P是由两种鞘氨醇激酶（SphK）同工酶——即SphK1和SphK2所产生。近年来，有研究证明S1P水平的升高可导致啮齿类动物罹患 PH。在哺乳动物细胞中，1-磷酸鞘氨醇裂解酶（SPL）是唯一一种催化S1P发生不可逆降解的酶。最近报道称在从PH患者体内分离出来的肺组织和肺动脉平滑肌细胞中，SphK1的表达和S1P的水平显著提高。此外，有研究表明SphK1被敲除的小鼠不会罹患缺氧诱导的PH。以上结果均表明SphK1介导的S1P信号通路在PH的发病过程中发挥着关键性的作用。然而，SPL是否可以通过降低肺部S1P水平来改善PH的进展，这仍然是未知的。在缺氧诱导的PH小鼠模型中，我们发现肺组织SPL的表达明显下降，并且伴有肺部组织S1P水平明显的升高。通过药物抑制SPL的活性可以进一步升高肺部组织的S1P水平，加重PH引起的右心肥大以及肺血管重塑。与此相反，SPL过表达可以降低小鼠肺组织 S1P的水平以及延缓缺氧诱导的PH的进展。鉴于已有的研究发现，细胞外调节蛋白激酶1/2 （ERK1/2）在肺血管重塑及PH的发生中发挥着关键的致病作用。我们发现，药物抑制SPL可以升高缺氧引起的ERK1/2磷酸化水平，而SPL过表达可以降低与PH 发生相关的ERK1/2磷酸化水平。本研究首次表明，SPL可能是通过阻断S1P信号传导及降低S1P相关的ERK1/2磷酸化水平的方式来延缓PH的进展。因此，SPL可能有希望成为治疗PH的新靶点。　　研究目的：　　1.观察缺氧引发PH发生时，小鼠肺部组织内S1P及SPL水平的变化。　　2.观察抑制SPL对PH的影响。　　3.观察过表达SPL对PH的影响。　　4.初步探究SPL对PH的发生及进展产生影响的机制。　　研究方法：　　动物学实验：　　1.高压低氧舱建立PH小鼠模型　　为了进行PH相关实验的研究，我们首先建立PH小鼠模型。我们取8周龄大的C57BL/6J 雄鼠，分两组，每组7只，一组作为Control组正常饲养，一组放置在高压低氧舱中每天16个小时，高压低氧舱环境为50Kpa大气压强，10%含氧量。8周后，进行一系列检测。M 型超声检测两组小鼠的心脏功能及结构。使用组织学分析法检测两组小鼠的肺动脉壁厚度。通过蛋白印迹技术（Western Blot）检测 SPL 与α-SMA的水平。（α-SMA是平滑肌细胞的标记物，其表达升高，代表平滑肌的增生明显。)通过ELISA试剂盒，检测肺部S1P水平。使用荧光分析法测定SPL的活性。通过以上实验结果，判定PH小鼠模型是否建立成功。　　2.通过抑制SPL的活性来观察SPL对PAH的影响　　为了明确地观察在抑制SPL活性后对于PH的影响，我们将8周龄大的C57BL/6J雄鼠分为Control及PAH8W组（低氧舱8周处理），分别给予THI（SPL特异性抑制剂 25mg/L，溶解于 10g/L 葡萄糖水）与对照溶剂（Vehicle，10g/L 葡萄糖水）进行饲养。在饲养8周后，使用M型超声检测各组小鼠的心脏功能及结构；使用组织学分析法检测肺动脉壁厚度；通过 Western Blot 检测 SPL与 α-SMA的水平；通过ELISA试剂盒，检测肺部S1P水平；通过荧光分析实验检测SPL的活性。　　3.利用SPL过表达小鼠（SPL-TG小鼠）观察SPL对PAH的影响　　为了进一步探究SPL与PH的关系，我们构建了SPL-TG（携带SPL转基因，其SPL的表达及活性较WT型小鼠升高近3倍）小鼠，来观察SPL活性及表达升高后对于PH的影响。我们分别对 8周龄大的C57BL/6J 雄鼠 SPL-TG型及 WT型进行Control处理以及低氧舱处理。正常饮食喂养8周后，分别对各组小鼠使用M型超声检测各组小鼠的心脏结构及功能；使用组织学分析法检测肺动脉壁厚度；通过Western blot检测SPL与α-SMA的水平；通过ELISA试剂盒，检测肺部S1P水平；通过荧光分析实验检测SPL的活性。　　4.观察在PAH发生的过程中，SPL对ERK1/2信号通路的影响　　为了探究SPL对于PH的发生产生影响的机制，我们将8周龄大的C57BL/6J雄鼠分为Control组及PAH 8W组，分别给予THI与对照溶剂进行饲养。8周龄大的C57BL/6J雄鼠SPL-TG型及WT型进行Control处理以及PH 8W处理，8周后，对各组小鼠肺部组织蛋白进行提取，使用Western Blot技术，检测各组小鼠肺部组织蛋白ERK1/2磷酸化的水平。　　统计学分析：　　实验数据均采用平均值±标准差表示（Mean±SEM）。使用GraphPad Prism-6.0软件进行统计学分析。两组之间数据比较采用Student’s t-test分析。两组以上数据分析采用双因素方差分析（two-way ANOVA）后再进行post-hoc分析。所有数据以P＜0.05为统计学意义上有差异。　　研究结果：　　1.低氧诱导的PH小鼠肺组织SPL活性及表达降低　　1）低氧诱导产生PH的小鼠肺部组织的SPL水平降低，活性降低。　　在通过低氧诱导 PH 小鼠模型建立成功后，取小鼠肺部组织，提取蛋白，通过Western Blot技术检测SPL水平，相较Control组，PH组小鼠SPL表达降低。通过荧光分析实验检测SPL活性，PH组小鼠较Control组，其SPL活性同样明显降低。　　2）PH小鼠肺部组织的S1P水平增高。　　通过ELISA实验检测小鼠肺部组织S1P的表达，PH组小鼠相较Control组，S1P的水平明显升高。　　2.抑制SPL活性加重低氧诱导的肺高压　　1）THI加重了PH组小鼠心脏右室肥大的进程。　　超声心动图显示，经过PH 8W处理的小鼠，相较Control处理的小鼠，其心脏有明显的右室肥大现象的发生。而在使用THI处理后，THI组相较Vehicle组，右室肥大的情况更为严重。　　2）THI使SPL的活性降低，S1P水平增高。　　通过Western Blot技术，检查小鼠肺组织中的SPL水平，PH 8W处理的小鼠肺组织中的SPL表达相较Control处理时，明显下调。PH 8W处理的小鼠相较Control处理的小鼠，α-SMA表达明显升高，而在此基础上，THI处理后相较Vehicle处理，其α-SMA表达升高趋势更大。荧光分析实验显示，PH 8W处理小鼠的SPL活性相较Control处理的小鼠，其活性降低，伴随着ELISA实验结果显示S1P的水平明显升高。而THI组相较Vehicle组，这一变化更加明显，SPL活性降低更多，S1P水平升高的趋势也更为明显。　　3.SPL-TG小鼠低氧诱导的肺高压病理变化显著减轻　　1）SPL-TG小鼠相较WT小鼠，由低氧诱发的PH所引起的右室肥大的进程得到拮抗。　　超声心动图显示，PH 8W的小鼠相较Control组小鼠，有明显的右室肥大的发生。而在此基础上，SPL-TG组相较WT组，右室肥大的情况得到缓解。　　2）SPL-TG小鼠肺部组织的SPL表达及活性增高，S1P水平降低。　　通过 Western Blot 技术及荧光分析实验，检查肺组织中的SPL 表达及活性，SPL-TG组小鼠相较WT组小鼠，SPL表达及活性均明显升高。通过ELISA实验，我们发现PH 8W处理的小鼠相较Control处理小鼠，S1P水平明显升高，但SPL-TG组小鼠相较WT组小鼠，S1P水平升高的趋势得到缓解。　　4.在PH发展的过程中，SPL抑制了肺组织ERK1/2磷酸化水平，提示SPL可能通过ERK1/2信号调控PH进展。　　通过Western Blot技术检测小鼠肺部组织ERK1/2磷酸化水平。PH 8W处理后的小鼠相较Control处理的小鼠，ERK1/2磷酸化水平显著升高。而在应用THI降低小鼠SPL活性后，相较Vehicle处理的小鼠，THI组小鼠ERK1/2磷酸化水平上调的更高。而SPL-TG组小鼠使SPL表达及活性升高后，相较WT组小鼠，其ERK1/2磷酸化水平升高的趋势得到明显缓解。　　研究结论：　　1.我们首先观察了抑制SPL后对PH的影响。观察到抑制SPL的活性，会升高肺组织S1P的水平，加重了PH发展的进程。　　2.我们利用SPL-TG小鼠观察过表达SPL对PH的影响。观察到过表达SPL引起肺部组织S1P的水平的降低，从而使低氧引起的PH进程受到了拮抗。　　综上所述，本实验证实了SPL在PH的发生过程中发挥了重要作用。SPL活性的降低，所导致的S1P 信号通路的活化，是引起 PH 进展的一个关键因素。这也给我们提示，SPL可能是一个全新且有效的治疗PH的靶点。