犬骨髓间充质干细胞复合Bio-gide胶原膜修复股骨头软骨缺损的实验研究

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目的:拟研究以Bio-gide胶原膜作为细胞支架复合自体骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs)修复犬股骨头软骨缺损的实验可行性。方法:该实验于2012/05/30-2013/1/30在大连大学附属中山医院实验室完成,(1)每只犬在髂嵴抽取骨髓,分离自体骨髓间充质干细胞,并行体外培养及鉴定。(2)将犬骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜体外共培养,通过电镜观察。(3)将18只犬制作成双侧股骨头负重区关节软骨缺损模型,并随机分3组,实验组:BMSCs复合Bio-gide胶原膜修复股骨头负重区软骨缺损;对照组:单纯Bio-gide胶原膜修复股骨头负重区软骨缺损;空白组:股骨头负重区软骨缺损不做任何处理。(4)各组于术后12周处死动物,处死后对修复的股骨头软骨缺损处取组织标本,行大体形态学观察评分、组织学染色评分(HE染色和Masson三色染色)、Ⅱ型胶原免疫组化检查及透射电镜观察,根据关节软骨大体形态学标准与组织学标准评分行统计学分析。结果:(1)第3代骨髓间充质干细胞镜下观察:BMSCs生长形态良好,呈梭形或多角形,行HE染色、免疫荧光染色、电镜观察鉴定证实。(2)通过电镜观察体外培养的骨髓间充质干细胞能很好地贴附于胶原膜的粗糙面,细胞扩增并能复层生长。(3)术后12周取标本行大体形态学观察,实验组修复处呈类透明软骨样修复,对照组缺损处呈纤维组织样填充,空白组缺损处未见有效修复。组织学染色(HE染色和Masson三色染色)见实验组修复组织更接近软骨组织,细胞排列不规律,比正常软骨细胞略小,表层细胞呈梭形或椭圆形,大多数横向排列,深层细胞呈圆形或椭圆形,有软骨陷窝形成,修复区两侧与周围软骨愈合好;对照组修复组织主要为纤维结缔组织,周围软骨退变明显;空白组缺损处未见组织修复,偶见纤维组织部分充填。实验组的修复组织Ⅱ型胶原免疫组化染色见修复组织细胞及细胞外基质Ⅱ型胶原表达阳性,细胞中出现大量黄褐色或黄色颗粒;透射电镜观察修复组织中细胞类似于软骨细胞,呈椭圆形,细胞核清晰,较多异染色质分布于核膜边缘和核内,胞浆内有十分丰富的粗面内质网和囊泡,异染色质呈补丁样分布,有的细胞核和胞浆呈黑暗外观。(4)大体及组织学观察评分后进行统计学评分分析,差异有统计学意义,显示A组修复效果最优、优于B、C组。结论:骨髓间充质干细胞复合Bio-gide胶原膜可以在体内修复股骨头软骨缺损。
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