畜禽的骨骼肌不仅是生物体主要运动器官,也是人类获取优质蛋白的重要来源之一。在畜牧生产中,骨骼肌的生长发育直接影响着动物肉类的数量和质量。多数哺乳动物出生后骨骼肌纤维数目已经确定,肌肉量的增加主要依赖于出生后骨骼肌纤维的生长潜能。卫星细胞作为一种肌源性的祖细胞,具有干细胞特性,被激活后通过增殖、分化形成肌纤维,对于骨骼肌的发育和损伤修复具有重要意义。骨骼肌发育过程受到多种功能性分子调控,例如生肌调控因子(muscle regulatory factors,MRFs)、肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF2)家族、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGFs)、血清反应因子(Serum response factor,SRF)和非编码RNA等。近年来,长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)作为功能调控分子参与猪骨骼肌分化发育的研究备受关注。目前,已有数千种lnc RNA被挖掘,但其调控功能研究仍有待全面分析。其中就包括长链非编码RNA MEG3(Maternally Expressed Gene 3),尽管研究证实MEG3多个单核苷酸多态性位点与猪的肉质性状度密切相关(Yu et al.2018),那么与猪肉质性状直接相关的猪的骨骼肌发育方面,MEG3是否存在重要调控作用,以及其中的分子调控机制如何,都待进一步的探究。本研究利用5’/3’RACE、细胞核质RNA分离、Western Blot、流式细胞术、RIP、生物素化的mi RNA pull-down、Ch IP、双荧光素酶报告分析等技术对MEG3调控猪骨骼肌卫星细胞分化的分子机制进行阐释。主要研究结果如下:1、MEG3核心转录本在猪骨骼肌卫星细胞增殖与分化中呈规律性表达本研究通过5′/3′RACE、组织表达谱分析、细胞核质RNA分离等技术对猪MEG3基本序列特征进行了鉴定,发现猪MEG3存在两个不同的转录本,即MEG3 v1(1430bp)和MEG3 v2(1380bp)。其中MEG3 v2是其核心转录本,在肌肉组织中高表达,且在猪骨骼肌卫星细胞增殖期和分化早期表达量逐渐升高,分化后期逐渐降低。细胞核质RNA分离检测显示,MEG3 v2主要存在于Myoblast(77%)和Myotube(60%)细胞的细胞核中,但随着肌分化的发生,MEG3 v2在细胞质中的含量由Myoblast占比约23%增加至Myotube占比40%。2、MEG3抑制猪骨骼肌卫星细胞增殖,促进其分化在猪骨骼肌卫星细胞增殖阶段,通过CCK-8、Ed U、流式细胞术等技术检测MEG3对细胞增殖过程的影响,结果显示干扰MEG3表达后G0/G1期细胞数目减少,S期细胞增加,细胞增殖能力和DNA复制活性显著增强;而过表达MEG3不同转录本后结果与之相反,卫星细胞增殖过程受到抑制。在猪骨骼肌卫星细胞分化阶段,我们利用q RT-PCR、Western blot、免疫荧光技术检测MEG3对肌分化标志基因Myo D、Myo G、My HC的表达影响,结果显示干扰MEG3后,肌分化标志基因表达下调,Myo G、My HC阳性肌管数目减少,卫星细胞分化进程受到抑制;而过表达MEG3后结果与之相反。3、转录组学分析揭示MEG3具有调控猪骨骼肌肌生成的功能对干扰MEG3并诱导分化30h和40h的猪骨骼肌卫星细胞进行转录组测序分析,分别获得273和207个差异表达基因。分别对其进行GO富集和KEGG pathway通路分析,显示差异基因主要参与肌肉结构形成、骨骼肌收缩、肌细胞分化等肌肉活动相关生物学过程,并参与到PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、黏着斑等通路中,在转录水平进一步提示在猪骨骼肌肌生成过程中,MEG3具有重要调控功能。4、MEG3通过吸附mi R-423-5p调控SRF促进骨骼肌卫星细胞的分化经Target Scan和RNAhybrid在线软件预测发现,MEG3、mi R-423-5p、和肌生成关键转录因子SRF三者之间存在碱基互补配对序列。随着MEG3的干扰或过表达,SRF与之相同的表达趋势,但mi R-423-5p则呈相反的表达趋势。RIP分析结果显示,Ago2蛋白与MEG3结合,说明MEG3具有竞争性结合mi RNA的能力。生物素标记的mi R-423-5p pull-down分析显示mi R-423-5p能显著富集MEG3和SRF,但结合位点突变后的mi R-423-5p却失去这种结合能力。进一步的双荧光素酶报告分析表明mi R-423-5与MEG3之间存在竞争性结合关系,且MEG3能以剂量依赖的方式减轻mi R-423-5p对靶基因SRF的抑制作用。随后我们利用过表达载体和RNAi技术证明了SRF对骨骼肌卫星细胞分化的促进作用。并且MEG3的过表达可减轻mi R-423-5p对SRF蛋白表达和Myo G+、My HC+阳性肌管形成的抑制作用。综合分析表明,在肌生成过程中,MEG3作为ce RNA,可以通过吸附mi R-423-5p来减轻对SRF的抑制作用,进而促进猪骨骼肌卫星细胞的分化。5、SRF通过调控MEG3转录促进猪骨骼肌卫星细胞分化本研究利用双荧光素酶报告系统,分析并确定了MEG3的核心启动子区域(MEG3-CP)(转录起始位点上游-558bp至-226bp区域)。随后,通过动物转录因子数据库Animal TFDB 3.0和Jaspar在线预测了MEG3核心启动子区域转录因子结合情况,结果显示在转录起始位点上游-365bp至-360bp区域和-33bp至-28bp区域分别存在两个相同的SRF保守结合位点(CCCAGC)。为寻求SRF与MEG3核心启动子区域互作的直接证据,本研究分别进行了Ch IP和双荧光素酶报告分析。Ch IP-PCR结果显示,SRF在MEG3核心启动子区域显著富集。构建MEG3核心启动子处SRF结合位点点突变载体(MEG3-CP-mutant)后进行的双荧光素酶活性检测结果显示MEG3-CP双荧光素酶活性会随着SRF的干扰或过表达而降低或升高,但突变型MEG3-CP-mutant双荧光素酶活性却不受SRF表达的影响。结合SRF促进卫星细胞分化的研究结果,我们推断SRF可能通过与MEG3核心启动子上的结合位点相互结合,调控MEG3的转录,进而促进猪骨骼肌卫星细胞的分化。在猪骨骼肌卫星细胞发育过程中,本研究阐明了MEG3具有抑制其增殖促进分化的重要调控作用,并首次提出了MEG3两种调控卫星细胞分化的分子作用机制,为研究猪骨骼肌发育及猪分子育种提供了理论基础。