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乳腺炎是奶牛尤其高产奶牛最为严重的疾病之一,不仅给畜牧业带来巨大的经济损失,还给人类健康造成巨大的威胁。生产实践中发现,在奶牛的泌乳初期和高峰期,乳腺炎特别是隐性乳腺炎的发病率升高与增喂精饲料导致的瘤胃菌群紊乱密切相关。有研究证明,高精料诱导的奶牛瘤胃菌群紊乱会促使条件致病菌过度生长和繁殖,引起脂多糖(LPS)持续释放入血,诱导机体系统性低度炎症。当奶牛产后大量泌乳时,乳腺血流量增加,可能会导致LPS随着血液循环在乳腺组织中聚积,并且我们前期研究表明,LPS乳腺灌注会破坏血乳屏障,导致炎性细胞向乳腺组织募集,诱导乳腺炎的发生。因此,我们推测奶牛在泌乳初期和高峰期的乳腺炎发病率增加与瘤胃菌群紊乱有直接关系,并提出如下理论假设:由于饲料变更、环境变化等应激因素导致奶牛瘤胃菌群紊乱,有害菌大量繁殖,持续释放LPS入血,诱导机体发生系统性低度炎症反应;当奶牛发生泌乳应激时,伴随乳腺血流量的增加,会有更多的LPS进入乳腺组织,从而破坏血乳屏障,致使跨血乳屏障迁移至乳腺的炎性细胞显著增多,表现为以乳汁中体细胞数(SCC)超标为特征的隐性乳腺炎;当外部环境中存在病原菌等致病因素作用于乳腺时,诱导更多的炎性细胞进入乳腺,导致乳腺炎的严重性增加。为了验证这一理论假设,我们开展了如下实验:首先,将小鼠分为未处理组(正常小鼠)、肠道菌群紊乱组(饮水中添加广谱抗生素扰乱肠道菌群)和粪菌移植组(对抗生素处理的小鼠移植正常小鼠的粪便),并对三组小鼠乳腺灌注金葡菌建立乳腺炎动物模型,通过对不同组别小鼠的乳腺组织病理学变化、炎性细胞因子、髓过氧化物酶(MPO)活性和血乳屏障渗透性的检测,研究肠道菌群紊乱对乳腺炎的影响。结果表明,肠道菌群紊乱导致小鼠乳腺腺泡结构改变,炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的产生以及MPO活性显著升高,同时血乳屏障和肠屏障受损,而对肠道菌群紊乱的小鼠移植健康小鼠粪便后,乳腺组织的炎性反应得到显著改善。并且,与未处理组小鼠相比,肠道菌群紊乱组小鼠乳腺感染不同浓度的金葡菌后,乳腺组织的病理学损伤、炎性细胞因子的产生以及MPO活性升高的更加明显,而与肠道菌群紊乱组小鼠相比,粪菌移植组小鼠乳腺感染金葡菌后乳腺炎症反应显著缓解。上述结果表明,肠道菌群紊乱增加血乳屏障渗透性,诱导乳腺炎症以及增加金葡菌性乳腺炎的严重程度。其次,通过对奶牛饲喂高精料(精粗比:7:3)诱导亚急性瘤胃酸中毒(SARA)这一典型的奶牛瘤胃菌群紊乱动物模型,通过检测发现SARA导致奶牛瘤胃液和血液中LPS浓度显著升高,同时血液中中性粒细胞、白蛋白、谷草转氨酶(AST)、炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和血清淀粉样蛋白A(SAA)浓度显著升高,表明SARA导致奶牛瘤胃源LPS入血诱导机体发生系统性低度炎症;此外,SARA导致奶牛血乳屏障紧密连接蛋白表达显著降低,乳汁中SCC和炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及SAA含量显著升高,同时乳腺组织出现病理性损伤以及炎性细胞因子大量产生,表明SARA增加奶牛血乳屏障渗透性,诱导乳腺炎的发生;进一步检测发现SARA导致奶牛乳静脉、乳汁和乳腺组织中LPS浓度显著升高,并且对小鼠皮下植入渗透压泵缓慢持续释放LPS建立的系统性低度炎症模型导致乳腺组织出现病理性损伤、炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的产生和MPO活性显著升高以及血乳屏障渗透性增加。这些结果表明,SARA导致奶牛瘤胃内LPS持续释放入血,通过血液循环进入泌乳的乳腺组织,破坏血乳屏障,致发乳腺炎。进一步通过对健康和SARA奶牛瘤胃液、乳汁、粪便和血液菌群进行16S rRNA基因序列分析探索SARA诱发的奶牛乳腺炎与瘤胃、乳汁、粪便和血液菌群的相关性。结果表明,尽管奶牛乳汁、瘤胃液、粪便和血液中存在着各自不同的菌群群落,但是当奶牛发生SARA后乳汁和瘤胃液的菌群结构变得更加相近,均主要表现为寡养单胞菌(Stenotrophomonas)的丰度显著升高;通过韦恩图分析表明,SARA奶牛瘤胃液、乳汁和血液共有的核心菌属占瘤胃液总菌属的比例,乳汁总菌属的比例,以及血液总菌属的比例均显著升高,表明可能有某些细菌在三者之间进行了移行;通过LEfSe分析表明,Stenotrophomonas在SARA奶牛瘤胃液、乳汁和粪便中富集,但是并没有检测到细菌在SARA奶牛血液中富集,也未能够在血液中分离到Stenotrophomonas,表明SARA诱导的奶牛瘤胃液和乳汁菌群变化的一致性可能并不是由于Stenotrophomonas通过血液迁移所致;随后,通过对小鼠灌服嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia(S.maltophilia),Stenotrophomonas中唯一的菌种)探索肠道内高丰度的Stenotrophomonas与乳腺炎的相关性,结果表明,灌服S.maltophilia导致小鼠乳腺组织出现病理性损伤以及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量显著升高。这些结果表明,SARA导致奶牛瘤胃内大量升高的Stenotrophomonas是其诱发乳腺炎的内源性途径之一。最后,通过对健康和SARA奶牛乳腺灌注金葡菌后对乳成分和乳汁中金葡菌的载量进行检测,探索SARA对奶牛金葡菌性乳腺炎的影响。结果表明,金葡菌感染导致奶牛乳汁中乳脂、乳糖和干物质的含量显著降低,乳蛋白和SCC显著升高,并且,与健康奶牛相比,SARA奶牛乳腺感染金葡菌后乳成分的变化更加明显,同时乳汁中金葡菌载量更高。这些结果表明,SARA弱化了奶牛乳腺组织对病原菌的清除能力,进而增加了乳腺炎的严重性。通过上述研究,本课题证明了奶牛瘤胃和乳腺之间存在重要的关联,且这种关联与乳腺炎的发生密切相关。具体表现为:SARA导致奶牛瘤胃菌群紊乱,持续释放LPS入血诱导机体发生系统性低度炎症,并且在泌乳的乳腺组织中富集,破坏血乳屏障,诱发乳腺炎;此外,SARA诱导的奶牛瘤胃内大量增殖的Stenotrophomonas同样是致发乳腺炎的重要内源性诱因,但是具体的关联机制仍不清楚;同时,SARA弱化了奶牛乳腺组织对病原菌的清除能力,从而增加了乳腺炎的严重性。该实验结果不仅为临床防治奶牛乳腺炎提供了新的理论指导和实验依据,而且对其它感染性疾病的防治也具有重要的借鉴意义。