心肌肥厚、心衰是高血压、缺血性心肌病、心瓣膜病等许多心血管疾病的常见合并症,心肌肥厚、心衰常常伴发心律失常,特别是心衰期心源性猝死(SCD)的发生率大大增加。近年来,尽管在心衰的药物治疗上已取得很大的进展,但心衰病人的死亡率仍然较高。故揭示心肌肥厚、心衰病理过程中心律失常产生的分子机制,寻找有效的防治措施,是心血管领域研究的重要课题。在心肌肥厚、心衰发展中,伴随着心肌组织学上肥厚性重构变化,心肌细胞的电生理特性亦发生重构性改变,主要表现为复极化过程延迟而致动作电位时程(action potential duration,APD)延长,目前对此病理情况下APD延长如何诱发心律失常产生的机制仍了解不多。近年的实验发现,左心室跨壁复极离散度(transmural dispersion of repolarization, TDR)的增大在折返性室性心律失常的发生和维持中起重要作用。迄今,尽管有实验显示心衰时TDR增大,但心肌肥厚、心衰病理模型的跨壁APD变化报道结果不一。心肌动作电位时程取决于去极化和复极化电流相互之间精细的平衡,任何内向电流的增加或/和外向电流的减少均可使其延长。实验表明,L-型Ca电流(ICa-L)的变化依实验动物的种类和心衰进展的程度报道结果不一,而瞬时外向钾电流Ito的下调则似是较为普遍的现象。已在不同原因所致的多种实验动物(包括狗、兔、大鼠、猫等)心肌肥厚、心衰模型及心衰的人心室细胞上观察到Ito的减小。故对Ito在心肌肥厚、心衰病理状况下的变化成为目前该领域研究的热点。然而,小鼠作为目前电生理研究常用的模型动物,心肌肥厚、心衰时对Ito有限的几篇报道结果却极不一致。除Ito外,参与心室复极化的电压依赖性K+电流尚有IK,slow和Iss,在病理情况下IK,slow和Iss的改变却报道很少。另外,心肌肥厚、心衰时K+电流改变的细胞内信号传导通路尚不清楚。本实验拟在小鼠心肌肥厚、心衰模型上,采用膜片钳技术,观察不同病理发展阶段小鼠心室肌内膜下、外膜下心肌细胞动作电位、L-型钙电流(ICa-L)、电压依赖性K+电流Ito、IK,slow及Iss随时间变化的特点,并通过应用calcineurin的特异性抑制剂环孢素A(CsA),探讨K+电流病理性改变可能的细胞内信号传导通路,为揭示心肌肥厚、心衰的电生理重构特征及其机制提供实验依据。第一部分心肌肥厚和心衰不同时期小鼠左心室跨壁动作电位的变化目的:观察了小鼠由健康正常状态逐渐向心肌肥厚、心衰转变过程中,左室游离壁心内膜下、心外膜下细胞动作电位时程及跨壁异质性的变化,为揭示心律失常产生的细胞机制提供实验依据。方法:(1)动物模型制备:将小鼠深麻醉后开胸,暴露主动脉弓,部分分离:用外径0.4mm针头与主动脉弓平行结扎,抽出针头,使主动脉弓狭窄65%-70%。术后左心室后负荷增加,血液流出受阻,造成压力超负荷性心肌肥厚和心衰的动物模型;观察动物的一般状况并测定心指数和血流动力学各参数(LVSP、±dp/dt)。(2)酶解法分离小鼠左室游离壁内、外膜下心肌细胞:取下酶解好的心脏,将左室游离壁的心底和心尖部去掉,用眼科剪平行于左室游离壁中间部分分别剪取心内膜下心肌(0.5mm左右)和心外膜下心肌(0.5mm左右),分别放在KB液中轻柔吹打,用200目筛网过滤,获得的细胞在室温(23℃～25℃)下静置2 h后备用。(3)采用打孔式膜片钳技术记录单细胞动作电位,静息膜电位在-65 mV以上的细胞予以波宽10 ms,1Hz的方波,100% ~ 120%阈电流诱导动作电位,计算出APD,包括动作电位复极达50%的时程(APD50)、动作电位复极达90%的时程(APD90)。在电压钳下以钳制电压为-40 mV,超级化-20 mV得到的细胞电容电流积分值,计算出细胞电容。结果:(1)小鼠主动脉弓不完全狭窄术后,2 ~ 7周心质量指数和血流动力学各参数呈进行性上升,该时期为代偿性心肌肥厚阶段;8 ~ 13周LVSP、±dp/dt呈下降趋势,该时期为失代偿性心力衰竭阶段。(2)各Sham组左室内膜下细胞与外膜下细胞的电容非常接近,即两层细胞大小没有差别。主动脉狭窄术后2w,内膜下细胞就开始进行性增大(P<0.01),与同期Sham组相比,Band 2w,5w,9w和13w组分别增大了25.5%,29.1%,34.9%,54.4%。同样,外膜下细胞显示相似的增加,内、外膜下细胞大小无明显差别(P>0.05)。(3)各期Sham组内膜下细胞和外膜下细胞AP形态和APD存在着明显的差异,内膜APD明显长于外膜。狭窄主动脉后不同病理时间内、外膜下细胞AP呈现不同的变化特征,与同期的Sham组相比,内膜下细胞APD50于狭窄2w时没有改变(P >0.05),但是5w时即明显延长,而到失代偿的13w心衰时则大大延长,Band 5w、9w和13w分别延长了27%、82%和406%;APD90在代偿性肥厚阶段(Band 2w、5w)时没有明显改变(P>0.05),而在心衰期明显延长,9w和13w分别延长96%和364%(P<0.01)。与内膜AP变化形式不同,外膜下细胞APD90从2w开始就明显延长,而且不随病理过程进展而变化, Band 2w、5w、9w及13w APD90分别延长116%、192%、174%及154%(P<0.01)。虽然APD50于Band 2w时有延长趋势,但没有统计学差异(P>0.05),而与同期的Sham组相比,Band 5w、9w和13w APD50则分别延长58%、84%和67%(P<0.01)。(4)不同时期小鼠的静息电位大约在-70mV左右,Band组与Sham组之间没有显著性差异。无论是Sham组还是Band组心肌细胞,心内膜AP的超射值均大于心外膜(P<0.01)。病理情况下,只有Band 2w组心内膜AP的超射值高于sham 2w心内膜组,余者未见差异。结论:(1)在心肌肥厚的早期阶段(2周)即出现AP的延长,肥厚期外膜延长超过内膜,使跨壁复极梯度消失。(2)心衰期主要的变化是内膜AP的延长,造成内、外膜下心肌细胞复极离散度增大。即内、外膜下细胞生理跨壁复极梯度的消失或增大分别构成了肥厚、心衰两个阶段心律失常产生的细胞基础。第二部分心肌肥厚和心衰不同时期小鼠左心室跨壁L-型钙电流的变化目的:观察心肌肥厚、心衰时内膜下和外膜下心肌细胞L-型钙电流(ICa-L)的变化。方法:利用小鼠压力超负荷性心肌肥厚、心衰模型,在术后5周(Band 5w,心肌肥厚)和13周(Band 13w,心力衰竭)两时间点,采用全细胞膜片钳技术记录了左室游离壁内膜下细胞(Endo)和外膜下细胞(Epi)的ICa-L及其动力学改变。结果:(1)Sham组小鼠的Endo细胞和Epi细胞ICa-L密度没有差异; (2)5周和13周Band组Endo细胞的ICa-L密度与同期的Sham组相比明显降低,在+10mV ~ +40mV的4个电压下,5周Band组ICa-L密度分别降低了43%、43.5%、43.9%和43.6%(P<0.01),13周Band组分别降低了20.2%、21.4%、21.6%和25.7%(P<0.01),但其激活电位、峰电位和翻转电位没有改变。ICa-L通道的激活动力学、即时失活常数、稳态失活和失活后再恢复等动力学特征没有改变。而与同期的Sham组相比,5周和13周Band组Epi细胞的ICa-L密度无明显变化。结论:(1)生理状态下小鼠左心室内、外膜下细胞ICa-L密度不存在明显差别,提示ICa-L与APD跨壁异质性的产生无关;(2)心肌肥厚时内膜下细胞ICa-L减少,而外膜下细胞没有改变,ICa-L这种非同步的变化可能是此期AP跨壁梯度消失的离子基础。(3)同样,心衰时内膜下细胞ICa-L密度明显减少,而外膜下细胞ICa-L密度无明显改变,这种ICa-L的非同步变化在此期可起到对抗内膜APD延长,减少复极离散度的有益作用。即内、外膜下细胞ICa-L非同步性改变,可能在肥厚、心衰两个不同时期有着不同的作用。第三部分心肌肥厚、心衰不同时期左心室跨壁电压依赖性钾电流的变化目的:观察术后5周、13周(分别代表肥厚、心衰两个时期)左室游离壁内、外膜下细胞电压依赖性钾电流Ito、IK,slow及Iss的变化及其动力学改变,试图揭示心肌肥厚、心衰不同时期AP跨壁异质性改变的离子基础。方法:利用小鼠压力超负荷性心肌肥厚、心衰模型,采用全细胞膜片钳技术,观察了心肌肥厚(Band 5w)、心衰(Band 13w)小鼠左室游离壁内、外膜下心肌细胞电压依赖性钾电流Ito、IK,slow及Iss跨壁异质性的变化。各种电压刺激下得到电流的衰减相使用双指数拟和区分出三种电流成分Ito、IK,slow、Iss及其失活常数(τdecay)τ1和τ2,并观察了病理状况下通道的动力学特征。结果:(1)Ito变化:在所有假手术对照组动物,内膜Ito电流密度均明显小于外膜,具有显著的跨壁梯度。与同期同部位的Sham组相比,5w Band组内、外膜Ito电流密度明显降低(P<0.01),+60mV电压刺激下的电流密度值内膜降低了52.5%,外膜降低了41%。13w Band组内膜Ito电流密度继续降低,降低了67.3%(P<0.01),外膜虽然降低了43%(P<0.01),但与5w Band组外膜相比,没有进行性降低(P>0.05)。(2)IK,slow变化: 5w和13w时Sham组内、外膜IK,slow电流密度没有差别(P>0.05);与同期同部位的Sham组相比,5w Band组心内膜IK,slow明显降低,+60mV电压刺激下的电流密度值降低了40%(P<0.01),但是此时外膜下心肌细胞IK,slow没有变化(P>0.05)。13w Band组内膜IK,slow继续下降,减少了61.7%(P < 0.01),外膜亦明显下调,减少了32%(P<0.01)。内膜下细胞电流密度明显低于外膜。(3)Iss的变化: 5w和13w时Sham组外膜Iss电流密度轻度大于内膜(P<0.05);与同期同部位的Sham组相比,5周、13周时内、外膜下细胞Iss均显著下调,且内、外膜下降幅值相近,5周时分别降低42%和43%,13周时分别降低61%和57%。(4)即时失活常数(τ)的变化:虽然5w和13w sham组均显示出内膜Ito的失活常数(τ1)长于外膜,但是仅有5w sham组才有统计学差异(P<0.05),与同期Sham组相比,5w Band、13w Band组内、外膜下细胞τ1均明显延长。与τ1不同的是,IK,slow的失活常数τ2在5w和13w Sham组均没有表现出内、外膜的差异。与同期同部位的Sham组相比, 5w Band组内、外膜下细胞τ2均无改变,而13w Band时内、外膜下心肌细胞τ2均明显缩短,(+60mV电压下)分别缩短了22%和48%(P<0.01)。(5)稳态失活:与同期的Sham组相比,5w Band组内膜下细胞Ito的Vh无改变,而13w Band组内膜下细胞的Vh由-52.0±1.8变为-60.0±2.7(P<0.05),Ito失活曲线明显左移,即向超极化方向移位。与同期的Sham组相比,5w Band和13w Band心外膜下细胞的Ito的Vh向超级化方向移动,造成Ito失活曲线左移。与同期Sham组细胞相比,5w内、外膜下细胞的IK,slow的Vh、k值没有明显差异;13w Band组心内、外膜下细胞稳态失活曲线均向左(超极化方向)移位。结论:(1)生理状态下小鼠左心室内、外膜下细胞Ito密度存在明显的差别,即外膜高于内膜,这可能是AP生理跨壁梯度形成的主要离子基础。IK,slow和Iss密度不存在内、外膜下细胞的差别。(2)心肌肥厚阶段即存在显著的各种电压依赖性K+电流的下调,是动作电位延长的离子基础。Ito、Iss在内、外膜下细胞呈同步减少,IK,slow只是在内膜下细胞下调,加上ICa的非同步下调构成了此期AP跨壁梯度消失的离子基础。(3)心衰期突出的变化是Ito、IK,slow内、外膜下细胞非同步的下降,即内膜减少大于外膜,构成了AP跨壁异质性增大的离子基础。各种电压依赖性K+电流显著的非同步下调,是心肌肥厚、心衰不同阶段AP跨壁异质性表现的重要基础。第四部分Calcineurin信号通路在失代偿性心衰期K+电流下调中的作用目的:本实验通过应用calcineurin的特异性抑制剂环孢素A(CsA),阻断calcineurin信号通路,观察失代偿性心衰期小鼠心室肌内、外膜下心肌细胞电压依赖性钾电流Ito , IK,slow , Iss的改变,意图评价Ca2+i/CaM-calcineurin-NFAT通路在心衰期跨壁电压依赖性钾电流下调中的作用,为寻找可能的抗心律失常药提供实验依据。方法:在小鼠压力超负荷性心肌肥厚、心衰模型上,于术后9周起皮下注射CsA,25mg/Kg,2次/天,连续两周。实验分为:Band+CsA组、Band+Veh组,为进一步说明CsA对正常和病理状态下心肌作用的选择性,Sham周组中设与Band周同期的治疗组和对照组,即Sham+CsA组、Sham+Veh组。测定各组内、外膜下心肌细胞心质量指数,并对各组心肌组织进行组织病理学观察。同时采用全细胞膜片钳技术,观察了小鼠左室游离壁内、外膜下心肌细胞膜电容及电压依赖性钾电流Ito、IK,slow及Iss跨壁异质性的变化。结果:(1)Sham+CsA组和Sham+Veh组间、Band+CsA组和Band+Veh组间动物外观上无明显差异。Band+CsA组死亡率约为8%,较同时期Band+Veh组无显著性差异,Sham组动物无死亡。各组小鼠的体重无显著性差异(P>0.05)。心质量指数:Band+CsA组同Band+Veh相比,心指数降低(P<0.01),但没有减少到Sham+Veh组水平。细胞膜电容:与Sham+Veh组相比,Band+Veh组内、外膜下细胞明显增大,分别增大了63%和67%(P<0.01)。Band+CsA组同Band+Veh相比内、外膜下细胞膜电容减少,分别减少了28%和30%(P<0.01),但未完全恢复到Sham+Veh组水平(P<0.05)。各组内、外膜下细胞大小无明显差别(P>0.05)。(2)光镜下可见Sham+Veh、Sham+CsA组心肌纤维结构清晰,形态完整,排列均匀整齐,横纹清楚,细胞大小均一,仅有少量的胶原纤维,而Band+Veh组心肌纤维染色变浅,心肌细胞体积明显增大,排列紊乱,横纹不清或消失,细胞水肿,细胞核淡染或不清楚,局部心肌溶解,胞浆疏松化,Band+CsA组较Band+Veh组心肌纤维结构清晰,水肿减轻,变性程度减少。(3)Ito的变化:与Sham+Veh相比,Band+Veh组内、外膜Ito电流密度明显降低(P<0.01),内膜降低了66%,外膜降低了44%。CsA治疗后, Band+CsA组内、外膜细胞Ito电流密度均有所增加(P<0.01,P<0.05)),分别较Band+Veh组增加了84.7%和25.6%,但是没有完全恢复到Sham+Veh组的水平(P<0.01)。(4)IK,slow变化:与Sham+Veh相比,Band+Veh组内、外膜IK,slow电流密度明显降低(P<0.01),内膜降低了51.5%,外膜降低了29.3%,内膜电流密度显著小于外膜(P<0.01)。CsA治疗后,内、外膜细胞IK,slow电流密度均显著增大(P<0.01),与Band+Veh组相比,分别增加了87.5%和37.9%,完全恢复到Sham+Veh组的水平(P>0.05),同Sham+Veh组一样,内、外膜IK,slow的跨壁梯度消失。(5)Iss的变化:与Sham+Veh相比,Band+Veh组内、外膜Iss电流密度同比例下降(P<0.01),内、外膜均降低了56.0%。CsA治疗后,内、外膜下细胞Iss电流密度均显著增大(P<0.05),与Band+Veh组相比,分别增加了100%和26.7%,内膜Iss电流密度完全恢复到Sham+Veh组的水平,而外膜没有完全恢复(P<0.01)。(6)即时失活常数(τ)的变化:与Sham+Veh组相比,Band+Veh组内膜、外膜下细胞τ1(Ito的失活常数)明显延长,分别延长了80.7%和60.8%(P<0.01);CsA治疗对内、外膜下细胞Ito的失活常数无明显影响。与Sham+Veh组相比,Band+Veh组内、外膜下细胞τ2(IK,slow的失活常数)明显缩短,分别缩短了22.7%和47.3%(P<0.01);CsA治疗后,内、外膜下细胞τ2明显延长,分别延长37.1%和79.4%(P<0.01),完全恢复到Sham+Veh组的水平(P>0.05)。(7)稳态失活:与Sham+Veh相比,Band+Veh组心内、外膜下细胞的Ito失活曲线均左移。经CsA治疗后,内膜下细胞Ito失活曲线右移,并且完全恢复到Sham+Veh组的水平;而外膜下细胞Ito失活曲线没有改变。与Sham+Veh相比,Band+Veh组心内、外膜下细胞的IK,slow失活曲线均左移。经CsA治疗后,内、外膜下细胞IK,slow失活曲线明显右移,并且完全恢复到Sham+Veh组的水平。(8)与Sham+Veh组相比,Band+Veh组心内膜下细胞的APD显著延长,APD50和APD90分别延长了438.6%和410.5%,CsA治疗后,可部分逆转APD的延长,APD50和APD90分别较Band+Veh组缩短了65.8%和59.5%(P<0.01);与Sham+Veh组相比,Band+CsA组心外膜下细胞APD50和APD90分别延长了69.4%和139.6%,CsA治疗后,除部分对抗APD50延长外(与Band+Veh组相比,APD50缩短了21.3%),对APD90的延长没有明显影响(P>0.05)。(9)CsA对Sham组动物的一般状况、心质量指数、细胞膜电容、心肌组织形态及心室内、外膜下心肌细胞电压依赖性钾电流各种成分电流密度及动力学参数和APD均无明显影响。结论:(1)calcineurin信号通路是IK,slow病理性下调的主要原因。(2)Ito的下调除calcineurin信号通路外还有其他信号调节途径参与。(3)抑制calcineurin信号通路可以对抗心衰病理状态下电压依赖性钾电流Ito,IK,slow , Iss的重构,对内膜下细胞的抑制作用明显高于外膜下细胞,故降低了跨壁复极离散度。提示抑制该信号传导通路可望成为心衰心律失常和猝死的新的防治靶点。结论1.小鼠左心室内、外膜下细胞生理跨壁复极梯度的消失或增大分别构成了肥厚、心衰两个阶段心律失常产生的细胞基础。2.生理状态下小鼠左心室内、外膜下细胞ICa-L与APD跨壁异质性的产生无关;内、外膜下细胞ICa-L非同步性改变,在肥厚、心衰两个不同时期有着不同的作用:心肌肥厚时ICa-L非同步的变化可能是此期AP跨壁梯度消失的离子基础,心衰时ICa-L的非同步变化在此期可起到对抗内膜APD延长,减少复极离散度的有益作用。3.小鼠左心室各种电压依赖性K+电流显著的非同步下调,是心肌肥厚、心衰不同阶段AP跨壁异质性表现的重要基础。心肌肥厚阶段Ito、Iss在内、外膜下细胞呈同步减少,IK,slow只是在内膜下细胞下调,加上ICa的非同步下调构成了此期AP跨壁梯度消失的离子基础;心衰期突出的变化是Ito、IK,slow内、外膜下细胞非同步的下降,即内膜减少大于外膜,构成了AP跨壁异质性增大的离子基础。4. calcineurin信号通路是IK,slow病理性下调的主要原因。Ito的下调除calcineurin信号通路外还有其他信号调节途径参与。抑制calcineurin信号通路可以对抗心衰病理状态下电压依赖性钾电流Ito,IK,slow , Iss的重构,对内膜下细胞的抑制作用明显高于外膜下细胞,故降低了跨壁复极离散度。提示抑制该信号传导通路可望成为心衰心律失常和猝死的新的防治靶点。