研究目的:随着糖尿病的发病率增加、管理水平的提升和糖尿病患者寿命的延长,糖尿病相关并发症逐渐受到关注,其中糖尿病相关认知障碍已成为近几年研究热点。研究表明,中枢胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)可能在其中发挥重要作用,并逐渐引起学者关注。中枢胰岛素抵抗的发生常常伴随着慢性炎症、氧化应激等过程,其与胶质细胞的活化密切相关。因此,大脑胶质细胞,包括星形胶质细胞及小胶质细胞可能在糖尿病相关认知障碍过程中扮演重要角色,然而具体机制尚不明确。机体是一个整体,细胞之间相互作用,同样在脑组织中,神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞之间也存在着极其密切的联系,相互影响与支撑,共同维护大脑生理功能,并在疾病发生发展过程中发挥重要作用。然而,现阶段对于细胞间联系的相关研究较少,多细胞培养模型也尚不完善。因此,本研究拟建立神经元-小胶质细胞-星形胶质细胞三培养体系的胰岛素抵抗模型,并探究中枢胰岛素抵抗对小胶质细胞及星形胶质细胞活化和功能的影响,进而探讨中枢胰岛素抵抗引起神经元损伤的深层机制,为寻找糖尿病相关认知障碍的发病机制及干预靶点提供理论依据。研究方法:(1)建立实验组神经元-小胶质细胞-星形胶质细胞三培养体系,以及对照组神经元-小胶质细胞共培养体系,利用棕榈酸造胰岛素抵抗模型,通过western blot检测胰岛素抵抗通路活化的情况以验证IR模型成功建立;(2)通过尼氏染色观察胰岛素抵抗对神经元形态和尼氏小体的影响;MTT检测神经元活性;免疫荧光和流式细胞术检测神经元凋亡情况;通过western blot检测神经元突触可塑性相关蛋白的变化;(3)对小胶质细胞通过PCR、免疫荧光染色检测极化标志物i NOS(M1型)和Arg1(M2型)以明确其极化表型;蛋白芯片检测细胞因子分泌以评估其功能变化;(4)对星形胶质细胞通过PCR、western blot和免疫荧光染色检测极化标志物C3,i NOS(A1型)和Arg1(A2型)以明确其极化表型;q PCR检测神经保护相关基因变化以评估其功能变化;western blot检测NF-k B通路蛋白活化情况以探究其活化机制;(5)对共培养体系和三培养体系中的神经元通过免疫荧光检测i NOS水平变化;western blot检测i NOS下游BAD凋亡通路相关蛋白活化程度;Griess试剂检测上清亚硝酸盐水平以评估体系中NO的水平;流式细胞术检测神经元中ROS表达水平以评估氧化应激水平变化。研究结果:(1)神经元-小胶质细胞-星形胶质细胞三培养组与神经元-小胶质细胞共培养组在0.075m M棕榈酸造模情况下相比,星形胶质细胞对神经元胰岛素抵抗程度未引起明显差异,但是细胞活性减低、突起减少、突触可塑性相关蛋白(PSD95,synapsin1和p CREB/CREB)表达下降,凋亡情况增加,提示星形胶质细胞在中枢胰岛素抵抗引起的神经元损伤中发挥重要作用;(2)中枢胰岛素抵抗诱导小胶质细胞M1活化标志物,i NOS在转录水平和蛋白水平上调,M2活化标志物,Arg1在转录水平和蛋白水平下调,细胞因子TNF-a,IL-6,IL-1b,MCP-1,RANTES和GM-CSF的分泌明显增加;(3)M1活化的小胶质细胞可以激活星形胶质细胞中NF-k B通路,引起星形胶质细胞A1活化标志物,C3、i NOS在转录水平和蛋白水平上调,并下调星形胶质细胞抗氧化相关基因(Gpx8、Atox1)、线粒体相关功能基因(Ucp2、Cox8b、Atp5g1)、突触兴奋性相关基因(Sparc)和突触清除相关基因(Megf10、Mertk);(4)三培养体系相比于共培养体系,胰岛素抵抗引起神经元NO水平、i NOS和ROS表达明显升高,且i NOS下游BAD凋亡通路活化水平增高。研究结论:我们通过构建神经元-小胶质细胞-星形胶质细胞三培养体系,和对照组神经元-小胶质细胞共培养体系,给予棕榈酸建立中枢胰岛素抵抗模型,得出如下结论:(1)星形胶质细胞可以在中枢胰岛素抵抗损伤神经元活性、突触可塑性和加速神经元凋亡过程中起到重要作用;(2)中枢胰岛素抵抗可以使小胶质细胞活化为M1表型;M1表型的小胶质细胞进而使星形胶质细胞活化为A1表型,最终引起神经元损伤;(3)中枢胰岛素抵抗介导的胶质细胞活化可以通过提高神经元氧化应激水平、促进BAD凋亡通路最终引起神经元损伤。