Waardenburg综合症(Waardenburg syndrome,WS)是最常见的常染色体显性遗传性综合征型耳聋,根据临床特征分为4型(WS1-4)。由于表型的不全外显,基因型和表型之间无固定内在因果模式。中国人群WS的相关研究以基因组水平研究为主,主要限于小样本的家系调查和相关基因突变检测,MITF、PAX3和SOX10是主要的致病基因。在前期的研究中,我们对中南地区22例WS患者进行了临床诊断和分型(其中家系4个共9例,散发13例),WSl型5例,WS2型15例,WS4型2例。检测共发现9个新发杂合突变,致WS1的MITF基因突变T192fs和R217I；致WS1的PAX3基因突变H80D和H186fs；致WS2的SOX10基因突变G37fs, G38fs, R43X和E248fs；致WS4的SOX10基因突变W85X。这些基因突变导致WS的分子机制还不清楚。为进一步研究中国人群WS患者发病的分子机制,我们利用这9个新发突变对致病基因MITF、PAX3和SOX10的功能进行相关的一系列体外实验研究,包括突变基因真核细胞表达载体构建、Westernblot检测蛋白表达、荧光素酶检测蛋白活性、细胞免疫荧光观察亚细胞定位、免疫共沉淀检测蛋白相互作用及蛋白质DNA结合等,在转录和转录后水平研究突变蛋白功能改变及其对野生蛋白功能的影响。结果发现9个基因突变产生的突变蛋白功能均发生了改变。野生型和突变体真核细胞表达载体在293FT细胞内均能正确表达。荧光素酶活性检测发现除R217I MITF和H80D PAX3有部分残余功能外,其他突变体均失去功能,不能激活靶基因的转录活性。除E248fs SOX10具有显性负性效应外,其余8个突变体均不能影响其相应的野生型蛋白的正常功能。在NIH3T3细胞中的亚细胞定位研究发现R217I MITF、H80D PAX3和E248fs SOX10与野生型蛋白亚细胞定位一致定位于细胞核内,其余突变体出现异常的亚细胞定位,细胞核与细胞质均有分布,其中H186fs PAX3、G38fs SOX10以细胞核分布为主,T192fs MITF和SOX10的突变体G37fs、R43X、W85X以细胞质分布为主。免疫共沉淀发现H80D PAX3和H186fs PAX3均与野生型SOX10蛋白有相互作用,但二者失去与野生型SOX10蛋白的协同激活作用,不能协同上调MITF表达；5个SOX10突变体均不能与野生型PAX3产生协同效应而上调MITF表达水平,除E248fs SOX10外,其余4个SOX10突变蛋白均不能与野生型PAX3蛋白有相互作用。蛋白质与DNA结合实验发现E248fs SOX10与DNA产生结合,进一步支持其显性负性效应作用,但其半衰期变短,与野生型SOX10蛋白相比降解加快。本研究得出以下结论：(1) R217I MITF尽管与野生型MITF蛋白亚细胞定位相同并存有部分功能,但其剂量不足以达到野生型MITF蛋白行使正常生理功能所需水平。T192fs MITF无功能与其功能域bHLH-Zip的缺失及异常的亚细胞定位相关。这两个MITF突变蛋白通过下调酪氨酸酶基因表达。(2)尽管H80D PAX3的突变位于PD域内,但由于保留有完整的HD域而存有部分功能,并与野生型PAX3蛋白亚细胞定位相同；HD功能域的缺失和异常的亚细胞定位导致H186fs PAX3功能丧失。这2个PAX3突变蛋白失去与野生型SOX10的协同作用而下调MITF基因表达。(3) G37fs、G38fs、R43X和W85X产生的SOX10截断蛋白缺失所有功能域而导致功能丧失,失去单独或与野生型PAX3协同激活上调MITF基因表达作用。E248fs产生的截断蛋白保留有HMG功能域可与DNA结合而产生显性负性效应抑制野生型SOX10蛋白功能,但由于其降解较野生型SOX10加快,仍表现为功能丧失。本文首次对SOX10基因突变致WS2发病的分子机制进行了初步研究。(4)本研究中9个杂合基因突变产生的突变蛋白的功能与其功能结构域关系密切,导致WS的发病机理主要是单倍体剂量不足效应。突变蛋白剂量不足以达到野生型蛋白行使正常生理功能的最低阈值而实现黑素细胞完全发育。MITF基因突变通过下调酪氨酸酶转录水平、PAX3和SOX10基因突变通过直接下调MITF转录水平而影响黑素细胞发育并造成黑色素的合成、转运和分布障碍,导致虹膜、皮肤、内耳黑色素缺如而引起WS表型。(5)本研究在体外实验从分子、细胞水平较全面的揭示与阐述了中国人群WS的发病机制,建立了较为完善的WS致病基因功能检测的实验系统,为在动物水平体内试验进一步研究WS发病机制奠定了实验理论和基础。