垂盆草化学成分及质量研究

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1. 目的:垂盆草来源于景天科(Crassulaceae)景天属(Sedum)多年生草本植物Sedum sarmentosum Bunge.新鲜或干燥全草。垂盆草始载于《本草纲目拾遗》,原名狗牙半支。我国分布广泛,性凉味甘淡,新鲜或干燥全草入药。商品药材均为干燥品。垂盆草具有清利湿热、解毒之功,临床用于湿热黄疸、小便不利、痈肿疮疡、急、慢性肝炎的治疗,民间用于治疗各种肝炎。该药是中国药典收载品种,是垂盆草冲剂的主要成分。以前有人用垂盆草苷做指标成分,垂盆草苷遇热、遇碱不稳定,目前国内外没有此对照品,所以不宜用垂盆草苷做对照品。本课题是旨在研究活性成分的基础上,找出能控制质量的指标性成分即对照品,从而为控制质量提供科学依据。2. 方法:全文共分六个部分:一、对垂盆草进行了本草考证和生药学研究。二、化学成分的研究,用95%乙醇提取3次,回收乙醇,加水悬浮后,分别用不同溶剂萃取,得到氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部分,分别用硅胶、聚酰胺、Sephadex-LH-20、C18等柱制备色谱技术进行化学成分分离;用UV、IR、1HNMR、13CNMR等鉴定技术进行化合物鉴定。采用活性跟踪的方法,结合活性筛选的结果,对垂盆草进行了较为系统的化学成分研究;三、药理活性的测定研究,通过药材的功效来设计试验,通过动物或相应的体外模型来筛选、研究了化合物对小鼠脾脏T、B淋巴细胞转化增殖的影响、对四氯化碳损伤的原代培养大鼠肝细胞培养液中ALT含量的影响,从来确定有效成分。四、对照品的研究,根据药理活性的筛选结果和化合物的专属性来确定对照品,并对对照品的性质和稳定性进行研究。五、用TLC和HPLC法研究药材指标性成分的定性和定量方法。六、优先选用了HPLC法对垂盆草进行指纹图谱研究。结果:通过以上研究对垂盆草的质量控制方法取得了一定的进展。垂盆草95%乙醇提取物经不同极性的溶剂萃取,从氯仿、醋酸乙酯、正丁醇部分得到三萜类、黄酮类、甾醇类、硫醇类、硫醚类、有机酸类等共计三十一个化合物,经波谱解析、化学分析确定了其中二十个化合物的结构,它们分别为5,4′-二-羟基-3′,5′-二甲氧基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(tricin-7-O-β-D-glucoside I)、木犀草素(Luteolin II)、异鼠李素(Isorhamnetin III)、异甘草素(Isoliquiritigenin IV)、δ-香树脂酮(δ<WP=5>-Amyrione V)、3β,6β-豆甾-4,22-二烯-3,6-二醇(3β,6β-Stigmast-4,22-dien-3,6-diol VI)、槲皮素(quercetin VII)、β-谷甾醇(β-Sitosterol VIII)、胡萝卜苷(Daucosterol IX)、十五烷基硫醇(pentadecyl mercaptan X)、丁香酸(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid XI)、3,4,5-甲氧基苯甲酸(3,4,5-trimethoxybenzoic acid XII)、双十八烷基硫醚(dioctadecyl sulfideXIII)、棕榈酸(palmic acid XIV)、苯甲酸甲酯(benzoic acid methyl ester XV)、3-表-δ-香树脂醇(3-epi-δ-AmyrinXVI),δ-香树脂醇(δ-AmyrinXVII),β-D-半乳糖-(3-1′)-β-D-葡萄糖-(4′-1〞)-β-D-阿洛糖(beta-D-galactopyranosyl-(3-1′)-beta-D-glucopyranosyl-(4′-1〞)-beta-D-Allose XVIII)和KNO3、NaNO3(化合物 A 、B)。其中化合物X、VI、VII、XII、XIII、XIV、XV、XVIII是首次在该植物中发现。另还有9个化合物尚在鉴定中。体外活性实验表明化合物I能明显抑制小鼠脾脏T、B淋巴细胞转化增殖。化合物V能使四氯化碳损伤的原代培养大鼠肝细胞培养液中ALT含量显著降低;垂盆草乙醇提取液(正丁醇、乙酸乙酯、水萃取部分)也有一定程度的作用。本研究就指标性成分进行了研究,发现tricin-7-O-β-D-glucoside具有很好药理活性(免疫抑制作用)和专属性,故我们认为tricin-7-O-β-D-glucoside可以作为质量控制的一个指标成分。δ-香树脂酮能使四氯化碳损伤的原代培养大鼠肝细胞培养液中ALT含量显著降低,有很好的专属性,也可以作为指标性成分之一。研究并优化了对照品tricin-7-O-β-D-glucoside的制备工艺路线,认为直接用60%乙醇提取,得率比较高,在柱分离过程中直接用洗脱剂洗脱,接近对照品洗脱比例的时候,用对照品TLC跟踪,收集流份,提高了分离速度。研究并确定了对照品tricin-7-O-β-D-glucoside TLC定性鉴别和HPLC含量测定的方法,tricin-7-O-β-D-glucoside含量不得低于0.01%。对照品tricin-7-O-β-D-glucoside进行了初步稳定性试验研究,认为tricin-7-O-β-D-glucoside在室温较稳定,超过90℃开始变化,230℃基本破坏。在酸性条件下较稳定(Ph=2~3);而在碱性条件下较为敏感,当Ph>5时明显不稳定。研究并确定了δ-香树脂酮(δ- Amyrin)TLC定性鉴别和HPLC含量测定的方法,加工方法对δ-香树脂酮含量有明显影响,且有一定规律性,即含量由高到低的顺序为新鲜药材>自然晒干>60℃烘<WP=6>3. 干>水烫(95℃)>微波3分钟。不同采收季节对δ-香树脂酮含量也有影响,一般含量由高到低的顺序是9月>8月>7月>6月。从产地看四川峨眉山、北京香山的含量比较高。以上是考察了产地、加工方法、采收季节对δ-香树脂酮含量含量的影响。认为δ-香树脂酮含量不得低于0.5%,大于1.0%为较好。研究了不同产地、
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