研究背景乳腺癌发病率呈逐年上升趋势。尽管过去几十年,乳腺癌的诊断、治疗均取得巨大进展,但其死亡率紧随肺癌之后,位居第二。分子影像学的飞速发展,使人们对肿瘤的认识及研究进入了全新的分子时代,其突出特点是在细胞分子水平上实现对机体的实时、无创、动态、在体成像,对生物过程进行定性和定量研究,在疾病的早期诊断、肿瘤分期、疗效评价以及药物研发等方面有重要应用价值。尤其是多(双)模态分子影像学研究优势明显,是分子影像学发展的趋势,其核心内容是构建具有理想体内生物学特性的多(双)模态分子探针。以HAb18G/CD147为靶的肿瘤生物学特征多(双)模态分子影像学研究,可能有助于相关肿瘤的早发现、早诊断、转移预警、疗效评估以及预后评价等。目的:1.构建靶向乳腺癌膜相关抗原HAb18G/CD147双模态SPECT/MRI探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2,对其理化性质及生物学特性进行表征研究。2.培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468,探讨HAb18G/CD147在其中的表达及其意义,并进行双模态探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2的体外细胞毒性研究。3.初步探讨双模态探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2对人乳腺癌细胞的体外靶向性及特异性,并探讨其在正常小鼠体内的生物分布情况。方法:1.采用化学偶联法将超顺磁性氧化铁纳米颗粒SPIO与乳腺癌膜相关抗原HAb18G/CD147的单克隆抗体片段HAb18F(ab′)2共价结合,得到复合物SPIO-HAb18F(ab′)2;采用Iodogen法,对复合物SPIO-HAb18F(ab′)2进行125I标记,制备得到双模态靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2。本研究中采用SPIO及125I-HAb18F(ab′)2作为对照。应用透射电子显微镜、动态光散射仪等观察偶联前后SPIO及125I-SPIO-HAb18F(ab′)2的形态、大小及平均水合粒径,应用纸层析法计算125I-SPIO-HAb18F(ab′)2和125I-HAb18F(ab′)2的放射标记率,薄层层析法测定两者的放射化学纯度,并行体外稳定性实验及脂水分配系数(Octanol/water partition coefficient,log P)测定。采用1.5T MR磁共振仪对不同Fe2+浓度(3.0×10-2,2.0×10-2,1.5×10-2,7.5×10-3,3.75×10-3 mmol/l)的SPIO及125I-SPIO-HAb18F(ab′)2溶液行T2横向弛豫效率(r2)测定。2.培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(实验组)和MDA-MB-468(对照组),利用流式细胞术检测HAb18G/CD147在体外培养的乳腺癌细胞系中的表达情况。将靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2与非靶向探针SPIO分别与实验组MDA-MB-231细胞共孵育,行透射电子显微镜检测,观察靶向组探针在细胞内外的形态及分布,并与非靶向组比较。采用MTT法检测125I-SPIO-HAb18F(ab′)2及SPIO溶液对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞存活率的影响。3.(1)对与SPIO及125I-SPIO-HAb18F(ab′)2共同体外培养后的MDA-MB-231、MDA-MB-468及未作处理的MDA-MB-231细胞悬液(空白组)行MRI检测,对比其MRI信号强度的差异性,并计算MRI平均信号强度变化率;(2)体外细胞特异性结合实验:将与靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2及非靶向探针125I-HAb18F(ab′)2共同体外培养后的MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞悬液,在不同时间点(20min、40min、1h、2h、4h)经过离心、去上清及PBS重复冲洗后,用全自动γ放射免疫计数仪测每管放射性计数,分别计算其不同时间的细胞结合率并作统计学分析;(3)以125I-HAb18F(ab′)2为放射配基,进行体外细胞膜相关抗原竞争抑制实验,测定SPIO-HAb18F(ab′)2及HAb18F(ab′)2的半抑制率(IC50);(4)正常昆明小鼠32只,随机分为2组,于尾静脉分别注射125I-SPIO-HAb18F(ab′)2及125I-HAb18F(ab′)2,分别在15min、6h、24h、48h后解剖分离小鼠主要脏器及血液,测放射性生物(%ID/g)分布情况并进行血浆清除实验,计算125I-SPIO-HAb18F(ab′)2及125I-HAb18F(ab′)2的血浆半衰期。结果:1.本研究成功构建靶向乳腺癌膜相关抗原HAb18G/CD147的双模态SPECT/MRI探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2,透射电子显微镜测得SPIO的核心粒径为(10.32±1.3)nm;动态光散射仪检测SPIO和125I-SPIO-HAb18F(ab′)2的平均水合粒径分别为44.80 nm和52.64 nm;125I-SPIO-HAb18F(ab′)2及125I-HAb18F(ab′)2的标记率分别为41.9%和85.8%,二者放射化学纯度均大于95%,在PBS及新鲜鼠血清中均具有较好的稳定性,脂水分配系数log P值分别为(-0.99±0.03)和(-1.49±0.08),表明二者均为水溶性物质;MR扫描结果显示:SPIO的横向弛豫效率为38.79m M-1·s-1,125I-SPIO-HAb18F(ab′)2的横向弛豫效率为106.73m M-1·s-1。2.人乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468呈单层贴壁生长,流式细胞术检测结果证实MDA-MB-231细胞高表达膜相关抗原HAb18G/CD147,MDA-MB-468细胞呈低表达,其平均荧光强度分别为1353和162,前者约为后者的8.35倍。透射电子显微镜下显示125I-SPIO-HAb18F(ab′)2处理组:MDA-MB-231细胞靠近细胞膜及胞浆内见多个直径约20 nm的团块状致密电子密度颗粒集聚;SPIO组:纳米颗粒散在分布于MDA-MB-231细胞外周,无规律性,且距离细胞膜较远。MTT法测得125I-SPIO-HAb18F(ab′)2溶液在Fe2+浓度≤40μg/ml时对实验组及对照组细胞增殖均无明显抑制效应,差异无明显统计学意义(F值分别为0.78、0.66,P值分别为0.58、0.66);SPIO溶液在Fe2+浓度≤40μg/ml时亦对两种细胞增殖无明显抑制效应,差异无明显统计学意义(F值分别为1.01、0.17,P值分别为0.45、0.24)。3.(1)体外MR成像,MDA-MB-231细胞与靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2共孵育后呈明显短T2信号,余对照组及空白组呈明显高信号,测得MDA-MB-231细胞与靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2组、MDA-MB-231细胞与SPIO组、MDA-MB-468细胞与靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2组、MDA-MB-468细胞与SPIO组及空白组的信号强度平均值SI分别为(1670.5±4.55)、(1953.19±6.90)、(1932.31±7.89)、(2102.70±3.07)、(2348.63±13.50),差异有统计学意义(F=2859.60,P=0.000),与空白组相比,处理组信号强度改变率分别为28.87%、16.8%、17.72%、10.47%;(2)体外细胞特异性结合实验表明,实验组细胞可特异性摄取靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2及125I-HAb18F(ab′)2,其在不同时间点的结合率均高于对照组细胞,二组间有明显统计学差异(F值分别为11.99、23.70,P值分别为0.009、0.001);(3)体外细胞竞争抑制实验表明,SPIO-HAb18F(ab′)2对乳腺癌细胞膜相关抗原HAb18G/CD147保持了高亲和力,其IC50值为0.48nmol/L,HAb18F(ab′)2的IC50值为1.60 nmol/L;(4)正常小鼠体内生物分布实验:125I-SPIO-HAb18F(ab′)2的血浆半衰期约为8.85 h,主要浓聚于肝、脾并经肾脏排泄,10min时肝脏为(19.10±0.76)%ID/g、脾脏为(14.04±1.49)%ID/g、肾脏为(6.26±0.61)%ID/g,随时间延长,48h时肝脏为(2.70±0.43)%ID/g,脾脏为(1.96±0.65)%ID/g、肾脏为(0.45±0.02)%ID/g,分别降低了85.86%、86.04%、82.82%,肺、胃摄取相对较高,骨骼、肌肉分布较少;125I-HAb18F(ab′)2主要分布于血液中,其血浆半衰期约为10.38 h。结论:1.成功制备了靶向乳腺癌膜相关抗原HAb18G/CD147的特异性双模态SPECT/MRI探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2,该探针具有良好的理化性质和体外生物学特性,具有临床应用潜能。2.双模态靶向探针125I-SPIO-HAb18(ab′)2可高效标记HAb18G/CD147表达阳性的细胞,靶向性强,有望成为一种新型的HAb18G/CD147表达阳性的肿瘤的早期诊断手段。