目的:2,3,7,8-四氯二苯并二恶英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)属于多氯代二苯并二恶英(polychlorinated dibenzo-dioxins)类化合物,是环境中毒性最大的化合物之一,可以通过多种途径进入人体损害人的健康。子宫内膜异位症(endometriosis , EMs)是妇科的常见病,以盆腔疼痛、月经不调及不孕为主要特征,严重影响了患者的生活质量。近年来大量研究资料表明TCDD和EMs的发生发展关系密切。研究发现暴露在TCDD中不仅可以导致EMs的发生,还能够通过扰乱机体内环境加快EMs的发展。然而迄今为止,TCDD和EMs之间相互作用的机制还不十分清楚。EMs属于雌激素依赖性疾病,雌激素对于EMs而言起着至关重要的作用。细胞色素芳香化酶P450(cytochrome P450 aromatase,P450arom)是雌激素合成中的限速酶,在EMs中通过合成雌激素发挥重要作用。因此,我们推测TCDD影响EMs发生发展的途径之一可能是其促进了P450arom的表达从而使雌激素的合成增加。本实验通过建立小鼠EMs模型,并使用不同剂量的TCDD对小鼠进行宫内、宫外暴露或宫内宫外联合暴露,统计小鼠模型中异位灶的成活率,同时检测小鼠建模前后在位内膜及建模后异位内膜中P450arom的表达程度,以研究TCDD对小鼠EMs建模成功率的影响及其与P450arom之间互相作用的分子机制,为EMs的发病机理奠定实验基础和提供理论依据。方法:建立小鼠EMs模型,使用TCDD对其进行宫内、宫外或宫内宫外联合暴露,根据TCDD暴露的方式和剂量将小鼠模型分为五个小组:0-0组,3-0组,0-3组,3-3组和3-10组。观察并统计小鼠模型中皮下、腹膜和卵巢三处内异灶的成活情况,并采用RT-PCR技术和免疫组织化学技术检测建模前后小鼠模型在位内膜和异位内膜中P450arom的表达水平,探讨其与TCDD在EMs发生发展中的相关关系。所有数据应用SPSS17.0软件进行统计分析,结果采用均数±标准差表示,采用卡方检验进行异位灶成活率的比较,成活率的组内和组间比较需校正α,分别被校正为0.0125和0.0045;采用单因素方差分析、SNK法(方差齐时)和非参数检验(方差不齐时)进行P450arom表达情况的组间及组内比较,按α=0.05标准,P<0.05具有显著性差异。结果:1小鼠EMs建模后皮下、腹膜和卵巢三个部位异位灶总的成活率(即三个部位异位灶中最少有一处成活的概率)为100%(60/60),其中在五个组中,卵巢异位灶的成活率最高,为83%(50/60);腹膜、皮下异位灶次之,分别为53%(32/60)和35%(21/60);三个部位异位灶的同时成活率为20%(12/60)。据卡方检验结果显示,在五个组中,皮下、腹膜和卵巢三个部位异位灶的成活率是有差别的( X~2=29.187 ,P=0.000<0.0125),其中皮下和腹膜异位灶的成活率和卵巢相比有显著性差异(X~2=29.008,P=0.000<0.0125;X~2=12.478,P=0.000<0.0125),皮下异位灶和腹膜异位灶的成活率不具有显著性差异(X~2=4.089,P=0.043>0.0125)。在腹膜部位的异位灶中,3-3组异位灶种植的成功率与对照组(0-0组)相比具有显著意义(X~2=8.224,P=0.004<0.0045),其余各组之间的种植成功率不具有显著性差异(P>0.0045);皮下和卵巢异位灶中五个组之间的种植成活率不具有显著性差异(皮下:X~2=5.421,P=0.247>0.0045;卵巢:X~2=9.673,P=0.058>0.0045)。2 P450arom mRNA在建模前后五个组的在位和异位内膜中的表达2.1 P450arom mRNA在建模前五个组的在位内膜中的表达根据方差分析结果显示,建模前P450arom mRNA在五个组的子宫内膜中的表达是不同的,差异具有显著性(P=0.000),P450arom mRNA在0-0组,3-0组,0-3组, 3-3组,3-10组中的表达依次升高:即0-0组(0.0495±0.0031),3-0组(0.0612±0.079),0-3组(0.0814±0.073),3-3组(0.0926±0.042),3-10组(0.1016±0.0118)。根据SNK法分析结果,按a=0.05水准,任两组间的表达均有显著性差异(P<0.05)。2.2 P450arom mRNA在建模后五个组的在位内膜中的表达方差分析结果显示,建模后P450arom mRNA在各组小鼠的在位内膜中均有表达,表达量按0-0组,3-0组,0-3组,3-3组,3-10组的顺序依次增加,即0-0组(0.0902±0.0136),3-0组(0.1695±0.0072),0-3组(0.2367±0.0211),3-3组(0.2986±0.0139),3-10组(0.3644±0.0112)。且经SNK法结果表明,P450arom mRNA在五个组在位内膜的表达中具有显著性差异(P=0.000),任两组间在位内膜间P450arom mRNA的表达也均有显著性差异(P<0.05)。2.3建模后,P450arom mRNA在各组小鼠异位内膜中的表达2.3.1 P450arom mRNA在建模后五个组中皮下异位内膜中的表达P450arom mRNA在小鼠皮下异位组织中均有表达。根据非参数检验结果显示,P450arom mRNA在五个组异位内膜的表达中具有显著性差异(P=0.000),表达量按0-0组,3-0组,0-3组,3-3组,3-10组的顺序依次增加,即0-0组(0.1168±0.0013),3-0组(0.1980±0.0010),0-3组(0.2806±0.0048),3-3组(0.3873±0.0021),3-10组(0.4817±0.0038)。根据两个独立样本的非参数检验结果显示,按a=0.05水准,任两组间异位内膜间P450arom mRNA的表达均具有显著性差异(P<0.05)。2.3.2 P450arom mRNA在建模后五个组的腹膜异位内膜中的表达P450arom mRNA在小鼠腹膜异位组织中均有表达。根据非参数检验结果显示,P450arom mRNA在五个组在位内膜的表达中具有显著性差异(P=0.000),表达量按0-0组,3-0组,0-3组,3-3组,3-10组的顺序依次增加,即0-0组(0.1236±0.0009),3-0组(0.2269±0.0011),0-3组(0.3390±0.0043),3-3组(0.4345±0.0037),3-10组(0.5009±0.0016)。根据多个独立样本的非参数检验结果显示,按a=0.05水准,任两组间异位内膜间P450arom mRNA的表达均具有显著性差异(P<0.05)。2.3.3 P450arom mRNA在建模后五个组中卵巢异位内膜中的表达P450arom mRNA在五个组的卵巢异位内膜中均有表达。根据非参数检验结果显示,P450arom mRNA在五个组中的表达具有显著性差异(P=0.000),表达量按0-0组,3-0组,0-3组,3-3组,3-10组的顺序依次增加,即0-0组(0.1240±0.0014),3-0组(0.3277±0.0012),0-3组(0.4507±0.0015),3-3组(0.5646±0.0010),3-10组(0.6355±0.0011)。根据多个独立样本的非参数检验结果显示,按a=0.05水准,任两组间异位内膜间P450arom mRNA的表达均具有显著性差异(P<0.05)。3 P450 arom蛋白在建模前后五个组的在位和异位内膜中的表达3.1 P450 arom蛋白在建模前五个组的在位内膜中的表达建模前P450arom蛋白在0-0组中没有表达,在其余四个组中均有表达。根据方差分析结果显示,P450arom蛋白在四个组在位内膜的表达中具有显著性差异(P=0.000),表达量按3-0组,0-3组,3-3组,3-10组的顺序依次增加,即:3-0组(0.1464±0.0338),0-3组(0.1756±0.0472),3-3组(0.2345±0.0546),3-10组(0.2794±0.0330)。根据SNK法结果显示,按a=0.05水准,任两组间异位内膜间P450arom mRNA的表达均具有显著性差异(P<0.05)。3.2 P450 arom蛋白在建模后五个组的在位内膜中的表达P450arom蛋白在建模后五个组小鼠的在位内膜中均有表达。根据方差分析结果显示,P450arom蛋白在五个组的表达中具有显著性差异(P=0.000),表达量按0-0组,3-0组,0-3组,3-3组,3-10组的顺序依次增加,即0-0组(0.2084±0.0215),3-0组(0.2355±0.0248),0-3组(0.2663±0.0309),3-3组(0.2907±0.0353),3-10组(0.3173±0.0270)。根据SNK法结果显示,按a=0.05水准,任两组间异位内膜间P450arom mRNA的表达均具有显著性差异(P<0.05)。3.3 P450 arom蛋白在建模后五个组的异位内膜中的表达3.3.1 P450 arom蛋白在建模后五个组小鼠皮下异位内膜中的表达P450 arom蛋白在五个组小鼠皮下异位灶中均有表达。根据非参数检验结果显示,P450 arom蛋白在五个组中的表达具有显著性差异(P=0.000),且表达量按0-0组,3-0组,0-3组,3-3组,3-10组的顺序依次增加,即0-0组(0.2412±0.0136),3-0组(0.2664±0.0223),0-3组(0.2985±0.0333),3-3组(0.3509±0.0014),3-10组(0.4092±0.0017)。根据多个独立样本的非参数检验结果显示,按a=0.05水准,任意两组间的表达均具有显著性差异(P<0.05)。3.3.2 P450 arom蛋白在建模后5个组腹膜异位内膜中的表达P450 arom蛋白在五个组小鼠腹膜异位灶中均有表达。根据非参数检验结果显示,P450 arom蛋白在五个组中的表达具有显著性差异(P=0.000),且表达量按0-0组,3-0组,0-3组,3-3组,3-10组的顺序依次增加,即0-0组(0.2597±0.0014),3-0组(0.2988±0.0190),0-3组(0.3286±0.0220),3-3组(0.4425±0.0288),3-10组(0.5202±0.0115)。根据多个独立样本的非参数检验结果显示,按a=0.05水准,任意两组间的表达均具有显著性差异(P<0.05)。3.3.3 P450 arom蛋白在建模后5个组卵巢异位内膜中的表达P450 arom蛋白在五个组小鼠卵巢异位灶中均有表达。根据非参数检验结果显示,P450 arom蛋白在五个组中的表达具有显著性差异(P=0.000),且表达量按0-0组,3-0组,0-3组,3-3组,3-10组的顺序依次增加,即0-0组(0.2853±0.0219),3-0组(0.3381±0.0347),0-3组(0.4337±0.0514),3-3组(0.5409±0.0551),3-10组(0.6337±0.0293)。根据多个独立样本的非参数检验结果显示,按a=0.05水准,任意两组间的表达均具有显著性差异(P<0.05)。4建模前后,P450arom mRNA和蛋白在增生期(动情前期和动情期)和分泌期(动情后期和动情间期)中的表达不具有显著性差异(P>0.05)。结论:1小鼠模型中卵巢异位灶的成活率高于皮下异位灶和腹膜异位灶。2一定剂量的TCDD促进了小鼠模型中异位灶的成活。3建模前,小鼠在位内膜中P450arom的表达随TCDD暴露剂量和暴露时间的增加而增加。说明TCDD可能通过增加在位子宫内膜中P450arom的表达水平来增加EMs发病的风险。4建模后,P450arom在小鼠在位内膜中的表达随TCDD暴露剂量和暴露时间的增加而增加,且表达量比建模前高。说明TCDD可能通过继续增加在位内膜中P450arom的表达水平进一步恶化在位内膜的环境,并可能促使新的内异灶的发生。5建模后,P450arom在皮下、腹膜和卵巢异位内膜中的表达随着TCDD暴露剂量和暴露时间的增加而增加。说明TCDD暴露通过促进异位灶中P450arom的合成,加速EMs的发展。6建模后,P450arom在三个部位异位灶中的表达,卵巢异位灶最高,腹膜、皮下次之。说明了在小鼠EMs模型中,卵巢异位灶的病变程度可能最重,腹膜异位灶和皮下异位灶次之。7小鼠模型中TCDD的宫内、宫外及宫内宫外联合暴露均可能促进EMs的产生及发展,其中宫内宫外联合暴露比单一宫内或宫外暴露使患EMs的概率更高,病情也可能更严重。