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研究背景:胃癌是国内临床最常见的消化道恶性肿瘤,在各种恶性肿瘤中,胃癌的发病率居第2位,死亡率居第3位。目前,胃癌的临床治疗主要采用手术切除为主,辅助结合化学治疗的策略。虽然围手术期的新辅助化疗和术后化疗都与胃癌的预后和术后有效生存期密切相关,但获得性化疗耐药的发生成为影响临床化疗有效性的最主要原因。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)是嘧啶类抗代谢药物,临床上广泛应用于治疗包括胃癌在内的多种实体肿瘤,是化疗药物中的一线药物。5-Fu一方面通过在细胞内转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5F-dUMP)抑制脱氧胸苷酸合成酶,从而影响DNA的合成。另一方面,5-Fu在体内可以转化为5-氟尿嘧啶核苷,以伪代谢产物形式掺入RNA中干扰蛋白质的合成,特异性杀伤S期细胞。胃癌患者通常在化疗初始对5-Fu较敏感,但经过多次用药后逐渐会出现对药物的耐受,产生了获得性耐药,从而降低了 5-Fu的疗效,甚至会导致化疗失败。因此,深入研究5-Fu获得性耐药的机制对了解临床化疗耐药及提供肿瘤治疗的新策略十分重要。MicroRNA(miRNA)是真核生物存在的内源性、单链、非蛋白编码的小RNA分子,它通过抑制靶基因转录后翻译或降解靶mRNA来调控基因的表达。最近的研究表明,miRNA与肿瘤化疗敏感性有关,然而关于miRNA与胃癌氟尿嘧啶获得性耐药之间的关系以及耐药机制尚不清楚。研究目的:本研究拟通过体外构建胃癌BGC823细胞5-Fu获得性耐药株,在此基础上应用基因芯片筛选与胃癌5-Fu获得性耐药相关的miRNA,通过生物信息学分析和一系列生物学功能验证,寻找与耐药相关的miRNA调控性分子,探讨miRNA在胃癌5-Fu获得性耐药中发挥作用的分子机制,为临床检测及解决5-Fu治疗方案的耐药性提供基础研究资料。研究方法:1.采用药物浓度梯度递增法诱导建立对5-Fu耐药的胃癌耐药细胞株。2.应用miRNA表达谱芯片和全基因组表达谱芯片筛选胃癌氟尿嘧啶耐药细胞株与亲本细胞株间的差异性miRNA和mRNA,并采用实时荧光定量PCR技术验证筛选的差异基因。3.以在胃癌耐药细胞中低表达的miRNA-125b作为研究对象,进行包括靶基因预测、基因本体注释和KEGG信号通路富集等一系列生物信息学分析。应用双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-125b与ERBB2和ERBB3间的标靶关系。4.胃癌耐药细胞株 BGC823/5-Fu 瞬时转染 miRNA-125b mimics 或 miRNA-125b inhibitors后,应用MTT法、流式细胞术、Western blotting方法检测过表达或下调表达miRNA-125b对胃癌耐药细胞的细胞增殖能力、细胞周期、细胞凋亡以及其靶基因(ERBB2、ERBB3)、凋亡相关基因(BCL2、BAX)及可能涉及的通路基因(ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT)的蛋白表达水平,研究 miRNA-125b在胃癌耐药细胞中可能的作用机制。结果:1.成功诱导建立了胃癌氟尿嘧啶获得性耐药细胞株BGC823/5-Fu,耐药指数达到 18.75。2.通过芯片共筛选出29个差异miRNA和1186个差异mRNA。应用qRT-PCR验证差异 miRNA 中的 hsa-miR-125b、hsa-miR-125a、hsa-miR-100、hsa-miR-130a、hsa-miR-221、hsa-miR-194、hsa-miR-192 和差异 mRNA 中 ERBB2、ERBB3、PDGFB、BCL2、BAX、MDM2、TP53,结果显示在胃癌耐药细胞 BGC823/5-Fu和亲本细胞BGC823间存在显著的表达差异,其中hsa-miR-125b下调表达显著。3.应用生物信息学分析预测miR-125b的靶基因有ERBB2、ERBB3。进一步双荧光素酶报告基因实验证实miR-125b分别与ERBB2、ERBB3基因的3’UTR区有直接的靶向结合作用。4.在胃癌耐药细胞株中,过表达miR-125b可以使胃癌耐药细胞对5-Fu的药物敏感性显著增强(P<0.05);细胞周期由S期阻滞向G0/G1阻滞转变。Western blotting 显示 ERBB2、ERBB3、BCL2、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT 蛋白的表达下降,BAX表达升高(P<0.05)。转染miR-125b inhibitors,耐药细胞内miR-125b的表达进一步下调,耐药性增强。结论:1.多种miRNA的异常表达与胃癌细胞氟尿嘧啶获得性耐药相关。2.在本文所建立的耐药细胞中,miR-125b负性调控靶基因ERBB2、ERBB3的表达。3.miR-125b的表达可能影响胃癌细胞对化疗药物5-Fu的敏感性,是一个参与调控胃癌细胞氟尿嘧啶耐药性的重要因子。是一个参与调控胃癌细胞氟尿嘧啶耐药性的靶点。4.miR-125b对胃癌细胞5-Fu耐药性的影响主要通过靶向调控ERBB2、ERBB3的表达来改变的。