论文部分内容阅读
研究背景前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率在欧美国家仅次于肺癌,位居男性第二位。雄激素剥夺治疗(Androgen deprivation therapy, ADT)是进展期前列腺癌最常用的一线治疗方法。然而ADT对于进展期前列腺癌仅仅起到缓解的作用,而非治愈性的。大部分男性只有在治疗早期出现短暂的癌瘤缩小。治疗12～18个月后,几乎所有患者最终转为去势抵抗性前列腺癌(Castration resistant prostate cancer, CRPC),预后极差。目前,关于CRPC的发生机制极为复杂,主要包括雄激素受体(Androgen receptor, AR)依赖性和AR非依赖性两类机制。其中,AR依赖性的机制主要涉及AR基因扩增、AR基因突变,共调节因子异常及AR的非配体依赖性激活等。事实上,在去势治疗后,尽管体内雄激素水平显著下降,但AR及其介导的通路仍保持活跃状态。自从Higgins和Hodges两位科学家报道类固醇激素在前列腺癌进展和治疗中的重要性以来,雌激素(17β-estradiol, E2),作为一种典型的类固醇激素,在前列腺正常组织及前列腺癌中发挥的作用受到了越来越多的关注。众所周知,E2在体内主要是通过它的两个经典受体雌激素受体α (ERα)和雌激素受体β (ERβ)发挥各种各样的生物学作用。在前列腺组织中,ERa主要表达于组织的间质中,而ERβ主要表达于前列腺上皮的基底层和分泌层。传统观点认为：ERa介导E2对于生物体有害的效应,而ERβ介导着E2的抑癌效应。ERβ被认为在细胞增殖功能上可以拮抗ERa,并表现出一种抗侵袭和抗转移的潜能。然而,越来越多的证据表明ERβ在前列腺癌中也发挥着类似癌基因的作用。因此,ERβ在前列腺癌中的具体作用仍需更加深入的研究。SOX家族是一类SRY (Sex Determination Region of Y Chromosome)相关基因构成的基因家族,编码一系列SOX (SRY-related HMG-box)转录因子。迄今,已发现SOX家族包括20个成员,可分为A-H共8个亚族。SOX4基因是C亚族成员,参与胚胎发育、干细胞的维持和调控细胞分化。在许多癌症中,SOX4这个关键的转录因子的异常表达可以通过诱导上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)和转移的方式,与细胞加速增殖和凋亡抑制相关。SOX4在前列腺癌中可能扮演着一个转化性癌基因的角色。虽然已在接近三分之一的前列腺癌患者体内发现了SOX4的过表达,但SOX4基因过表达的分子机制仍不明确。实验方法免疫组织化学染色(Immuohistochemistry, IHC)用于检测SOX4蛋白的表达、分布特点,及其与ERβ之间的相关性,实时定量PCR和Western blotting被用于研究转录和蛋白表达水平。细胞免疫荧光染色和免疫共沉淀(co-Immunoprecipitation, co-IP)评估ERβ和AR的亚细胞定位及相互作用。通过染色质免疫沉淀实验(chromatin-Immunoprecipitation, ChIP)和荧光素酶报告基因实验探讨ERp和AR与SOX4启动子区的结合以及对启动子活性的影响。MTS,侵袭和划痕实验评估细胞功能。实验结果我们的研究发现,相比于激素依赖性前列腺癌(Hormone dependent prostate cancer, HDPC)病例,在CRPC中SOX4表达上调。前列腺癌的细胞LNCaP经过长期的雄激素剥夺后也观察到SOX4蛋白表达上调,这证实了IHC结果,并进一步提示SOX4在去势抵抗性前列腺癌中的潜在作用。体外数据表明,DHT以剂量依赖的方式显著下调LNCaP和VCaP细胞系中SOX4的mRNA和蛋白表达。我们还发现,DHT抑制SOX4表达的过程呈现时间依赖性。ChIP实验证实SOX4是AR的靶基因。在缺乏雄激素的情况下,E2通过ERp和AR之间的蛋白复合物的形成上调SOX4表达。敲除AR或ERβ可以抵消E2诱导SOX4表达,这表明,这两种受体是E2诱导SOX4表达所必需的。ChIP实验证实,在E2刺激后,ERβ和AR均结合到SOX4启动子。因此,无论是由DHT或E2激活,AR起着SOX4表达的转录调控的根本性作用。此外,AR可以在于不同的配体结合时可表现出不同的转录行为。在功能上,沉默SOX4显著减弱的E2促进PCa细胞增殖、侵袭和迁移的作用。在HDPC和CRPC的临床样本中,SOX4的过表达与ERβ阳性有显著相关性。结论综上,我们证明SOX4是一种新的雄激素抑制性靶基因。在缺乏雄激素环境下,E2可以通过诱导SOX4表达以促进PCa细胞的增殖,这提示SOX4可能在CRPC的过渡过程中发挥重要作用。机制上,我们的数据表明,AR信号通路控制SOX4表达,在接受不同配体刺激时,对SOX4表现出不同转录调控。这种细胞模型的存在,可以促进ERp和AR阳性PCa细胞通过诱导SOX4表达而逐渐发展为CRPC。