产甘油葡萄糖苷蓝藻的培养优化及产物分离

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由于蓝藻的光合能力以及它们清晰的遗传背景,研究人员通过基因改造的手段来改造蓝藻,使其能够生产不同的生物燃料。然而,目前蓝藻生产生物燃料的成本与传统化石燃料相比,仍然不占优势。因此,更可行的策略是利用蓝藻来生产其他高附加值的生物活性化合物,如甘油葡萄糖苷。  甘油葡萄糖苷(Glucosylglycerol,GG),是由一些受到胁迫的微生物合成的渗透保护物质。由于甘油葡萄糖苷具有稳定蛋白质结构和激活细胞内保护酶的能力,因此可以被用做蛋白稳定剂以及化妆品添加剂。日本一些传统发酵食品中,也被发现含有生物活性化合物甘油葡萄糖苷。另外,甘油葡萄糖苷可以作为渗透保护物质在异养细菌(如假单胞菌、寡养单胞菌)和蓝藻(如集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7002)细胞中进行从头合成和积累。但是,目前国际上对于甘油葡萄糖苷的获得主要是通过化学合成以及体外酶法合成,而通过蓝藻来生产甘油葡萄糖苷只有少数报道。本研究就是用基因工程改造的集胞藻PCC6803突变株ΔggtCDΔggpR来生产甘油葡萄糖苷,一方面通过培养优化来提高甘油葡萄糖苷的产量、降低生产成本,另一方面探索建立能够从蓝藻培养液中分离浓缩甘油葡萄糖苷的方法,为在不久的将来实现甘油葡萄糖苷产业化应用奠定基础。  本研究主要有以下内容及结果:  第一:为了延长产甘油葡萄糖苷藻株的培养周期,以生产更多的甘油葡萄糖苷溶液,我们选择半连续培养方式;为了减少半连续培养过程中频繁离心带来的成本增加,我们在培养之前先利用凝胶封装技术对产甘油葡萄糖苷蓝藻进行了封装。分别利用琼脂和海藻酸钙将藻细胞封装,在加盐BG11培养基中进行光照半连续培养,结果显示琼脂糖凝胶封装培养可以延长ΔggtCDΔggpR藻株的培养周期,进行7个周期,有效延长了培养时间,提高了产物收率,降低了成本。  第二:前期实验显示补加BG11培养基营养盐,藻细胞的生长及甘油葡萄糖苷的产量都有所提高。因此对产甘油葡萄糖苷蓝藻的培养基进行了优化,进行了单因子实验以及Plackett-Burman实验设计,以期能找到BG11培养液中显著影响甘油葡萄糖苷的因素,来降低生产成本。结果显示母液1对甘油葡萄糖苷产量提高有显著影响。  第三:利用培养实验中得到了大量的甘油葡萄糖苷溶液,用来探索甘油葡萄糖苷的分离方法,获得较为纯净的甘油葡萄糖苷样品。在本实验中,我们比较了多种大孔吸附树脂XAD系列(XAD-4、XAD-16、XAD-1600、XAD1180、XAD-761、XAD-7HP)、AB-8、D101,以及葡聚糖凝胶G-15、粉末活性炭对甘油葡萄糖苷的吸附分离效果。结果显示,粉末活性炭对甘油葡萄糖苷的吸附分离效果较好,从而对粉末活性炭的吸附分离进行了优化。由结果可知,活性炭用量5 g,乙醇洗脱浓度50%时,得到最佳的甘油葡萄糖苷吸附率为83.87%,洗脱率为76.57%。并且又利用纳滤膜对甘油葡萄糖苷溶液进行了分离实验,实验结果显示通过纳滤膜后,甘油葡萄糖苷产物得到浓缩,88%的甘油和90.2%的盐可以除去。
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