恶性肿瘤的转移和复发是导致肿瘤治疗失败的主要原因，肿瘤转移过程是一个复杂多步骤的癌细胞与宿主细胞相互作用的连续过程，包括癌细胞从原发灶脱离，侵袭周围组织，进入循环系统，逃避免疫监视，形成肿瘤血管，在远处器官形成转移灶。其中一个关键而必需的步骤是肿瘤细胞穿越基底膜，降解细胞外基质，侵袭周围组织和血管。很显然，阻断肿瘤细胞的转移和扩散是降低肿瘤死亡率和提高生存率的关键因素。但是，目前肿瘤转移的分子机制尚不清楚，缺乏有效的生物防治手段和措施，这也正是该研究领域所面临的重大研究课题。近年的研究提示，硫酸肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)是阻止肿瘤细胞转移和扩散屏障的重要构成成分，对其降解将破坏细胞外基质和基底膜的结构，促进肿瘤浸润和转移。 乙酰肝素酶(heparanase)是一种内源性β-葡萄糖醛酸酯酶，识别HSPG的多糖侧链—硫酸肝素链(heparan sulfate，HS)的特异结构，并将其降解为10-20个糖单位大小的短糖链。在肿瘤转移的过程中，肿瘤细胞过度表达乙酰肝素酶破坏细胞外基质和基底膜，降低细胞间质屏障功能，促进肿瘤细胞侵入基质和血管壁；另外，此酶还使细胞外基质中贮存的各种生物活性物质释放，诱发新生肿瘤血管形成；在人类肿瘤组织中，乙酰肝素酶的表达与肿瘤的侵袭转移程度、预后差呈显著正相关；动物实验更为其促进肿瘤转移提供了直接的证据。 乙酰肝素酶是迄今发现的唯一的作用于细胞外基质多聚糖成分的酶，为我们提供了一个研究开发抗肿瘤转移新药物的重要靶点，深入研究其结构、功能及在肿瘤转移中的分子机理并在此基础上开发其抑制剂将为肿瘤转移的治疗提供新方法。目前，国外已经克隆出乙酰肝素酶的全长基因，并在酵母细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞中表达出此蛋白。但是，有关乙酰肝素酶作为重要的抗肿瘤转移药物的研究尚刚刚开始，对其生物学特性，表达调控机制等方面的研究报道甚少，国内此类研究更属空白。得到乙酰肝素酶的基因序列，构建、乙酞肝素酶的基因分离、蛋白表达及其相互作用蛋白的筛选筛选有效的蛋白表达载体和宿主细胞并得到纯化蛋白和抗体，以及了解此酶的表达调控影响因素等是进一步研究中国人肿瘤组织乙酞肝素酶的变化特征和规律，以及研发具有自主权的抗乙酞肝素酶药物等的重要基础和前提。 本研究正是利用细胞培养，基因分离、克隆、表达，蛋白纯化等技术，分离乙酞肝素酶编码基因的全序列并分别在哺乳动物细胞和大肠杆菌中表达乙酞肝素酶蛋白，探讨该酶在细胞内的表达特征及影响因素(信号肤等)，加深对乙酞肝素酶生物学特性的了解，并为进一步了解乙酞肝素酶在防治肿瘤转移和扩散，判断预后等方面的生物学作用奠定了重要的基础。另外，本研究还运用蛋白质功能研究的重要技术一酵母双杂交技术，寻找与该酶相互作用的蛋白，研究乙酞肝素酶在体内与其它分子的相互作用机制，以探索其在细胞内定位，转运，激活，信号转导等过程。材料和方法:1、细胞总mRNA乙酞肝素酶基因的分离扩增: 培养HepGZ细胞，待细胞生长至80%汇合时，收集细胞，提取细胞总mRNA，反转录合成cDNA;设计乙酞肝素酶基因的上下游序列，以cDNA为模板，扩增编码基因的全长;直接将PcR产物克隆入pGEM-T克隆载体中进行测序鉴定。2、乙酞肝素酶在哺乳动物细胞中的表达二 真核表达载体的构建:运用亚克隆技术分别将乙酞肝素酶全长编码基因和不含信号肤的乙酞肝素酶基因克隆入真核表达载体中，构建pcDNA4瓜yc一His fuu HpA和pcDNA月迎涯yc一His partl任城两种载体，分别用PCR、酶切和测序的方法鉴定序列。 表达载体转染入细胞:采用脂质体转染法将构建好的真核表达载体peDNA4/Mye一His full HPA和pcDNA4从ye一His part HPA转染入cos一7细胞进行瞬时表达，用W七stem blot的方法检测其蛋白表达情况。筛选恒定表达乙酞肝素酶的CHO细胞株:将peDNA4从yc一His fuUH卫A郑州大学博士学位论文20()3届真核表达载体转染CHO细胞，用Zeocin筛选恒定表达细胞株，PCR和W七sternblot检测CHO细胞中基因转染和蛋白表达的情况。3、乙酞肝素酶在大肠杆菌中的表达及蛋白的纯化二 构建真核表达载体并转化入大肠杆菌表达蛋白:运用亚克隆技术将乙酞肝素酶的大小亚基分别克隆入原核表达载体pGEX一ZTK，构建融合表达载体和pGEX-ZTK一50KDHpA，用氯化钙法转染入大肠杆菌BLZI(PlyS，DE3)中，进行诱导表达。发酵:挑选表达量高的工程菌株进行发酵培养。 纯化:用直接稀释法将以包涵体形式表达的目的蛋白进行复性，离子交换层析法和免疫亲和层析法纯化目的蛋白。4、运用酵母双杂交技术筛选相互作用蛋白: 构建诱饵蛋白(bait Protein)表达载体:PCR法扩增乙酞肝素酶大亚基的基因序列，构建诱饵蛋白载体，分别用PCR、酶切和测序的方法鉴定载体的正确性。 转染酵母菌并测定其表达情况和自身转录激活活性:用PEG法将诱饵蛋白载体转染入酵母菌株AH109并进行表达，采用营养缺陷培养和x-a一gal活性分析检测其转