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目的:本研究旨在利用分子生物学和细胞生物学方法检测MMP14基因在卡波氏肉瘤(Kaposis Sarcoma,KS)中的表达水平,初步研究其在KS发病中的作用及与KSHV感染的关系,明确其在KS发病中的可能机制。
方法:收集23例新疆KS患者肿瘤组织、以及17例非KS患者的正常皮肤组织样本作为对照,分别采用Real-time PCR和免疫组化技术,从mRNA和蛋白水平检测样本中MMP14表达情况;利用基因重组技术构建MMP14真核表达载体,通过脂质体转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),用western-blot鉴定转染48小时后含外源性MMP14的细胞株,并观察转染后细胞的形态变化,用MTT法检测转染后细胞的增殖率等生物学特征变化;通过Transwell检测MMP14对细胞迁移的影响;使用MMP14的抑制剂GM6001抑制MMP14的表达,检测KSHV感染的HUVEC细胞中MMP14蛋白与VEGF蛋白表达变化的关系。
结果:(1)6例KS患者组织中MMP14基因的mRNA表达水平的最高值是5.5329,最低值是0.93027,平均表达水平为2.640±1.861,而6例正常皮肤组织中mRNA的表达水平最高值为2.4719,最低值为0.76075,平均表达水平为1.470±0.615,经方差齐性检验,方差组间不齐,进行近似t检验,t=1.462,p=0.193,p>0.05,差异无统计学意义。(2)免疫组化结果显示MMP14蛋白在KS患者组织中阳性表达明显高于正常皮肤组织,差异有显著性意义(X2=20.70,P<0.01),MMP14蛋白阳性反应程度在两组中有统计学意义(t=8.407,P<0.01)。(3)成功构建了MMP14基因的真核表达载体,将构建的重组体转染人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞48h后,检测有外源性MMP14蛋白的表达,增殖率检测结果显示不同转染时间和不同转染浓度转染MMP14重组体组与其他对照组相比增殖率明显增高,结果有统计学意义(p<0.05)。(4)转染MMP14重组体后,与转染空载体和未转染组相比,MMP14明显促进HUVEC细胞的迁移(55.4±2.9,12.4±1.1,12.4±0.5)。(5)抑制MMP14的表达,可以引起KSHV感染的HUVEC细胞里的VEGF蛋白的表达下调。
结论:(1).MMP14基因在KS组织和正常皮肤组织mRNA表达水平无差异和蛋白表达水平增高。(2).MMP14基因过表达能促进HUVEC细胞的增殖和迁移。(3).MMP14基因在KSHV感染的细胞中调节与肿瘤血管生成有关的血管内皮因子VEGF的表达。