心肺转流术(cardiopulmonary bypass, CPB)是心内直视手术主要的辅助手段,然而,CPB可以诱发全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),导致包括心、肺在内的全身各脏器功能障碍。CPB可造成心肌损伤,严重时可造成术后心脏功能损害,表现为心律失常、心衰等并发症。急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是SIRS在肺脏的集中表现,以肺内弥漫性炎症细胞浸润、肺毛细血管通透性增加和低氧血症为特征。心内直视手术术后急性呼吸功能不全的发生率高达15%-30%,由其导致的死亡人数占术后总死亡人数的30%。ALI在分子水平上表现为多种炎性介质和炎性因子的过度释放,促炎和抗炎反应失衡；细胞水平上表现为中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞的聚集和浸润；而临床上则表现为弥漫性肺泡和肺血管内皮细胞的损伤、肺组织水肿及肺不张等病理特征,严重者可出现急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)。因此,抑制CPB中全身炎症反应,探索有效的心肺保护措施对临床工作具有重要意义。药物干预在CPB相关SIRS的防治中具有重要作用。目前,较为确定的SIRS治疗药物有：类固醇类药物、乌司他丁、肝素和其他葡萄糖胺聚糖、磷酸二酯酶抑制剂如米力农和氨力农、抗氧化剂以及硝普钠等。但临床应用中存在疗效不满意和／或不良反应严重的问题,至今仍无安全有效的治疗药物。传统莨菪类药物应用于SIRS治疗多年,但因其对胆碱受体亚型无选择性以及副作用大,限制了其临床应用。盐酸戊乙奎醚(penehyclidine hydrochloride, PHC)是我国研发的新一代抗胆碱药,具有选择性M1、M3受体激动作用,对M2受体无明显作用,作用时间长,副作用少,为临床SIRS的防治提供了新选择。已有的研究显示,PHC具有改善微循环、降低毛细血管壁通透性、细胞保护以及减少溶酶体释放等作用,提示PHC可能对CPB诱发的SIRS具有治疗作用,进而对SIRS导致的心肺损伤有保护作用。目前,关于PHC脏器保护作用的报道较多,但其作用机制的研究较少。近年来内毒素信号转导通路成为研究热点。动物实验显示,PHC可抑制内毒素诱导大鼠ALI中核转录因子-κB(NF-κB) mRNA的表达,但PHC对内毒素特异受体CD14和TLR4的影响尚未见报道。CD14和TLR4是内毒素特异受体,位于信号转导通路的最上游,其激活可引起一系列下游分子的激活,最终引起NF-κB活化,使炎症因子大量表达,导致SIRS,甚至ALI、ARDS和MODS。由于CD14和TLR4位于信号转导通路的关键位置,是理想的治疗靶点,因此,抑制其跨膜信号转导对ALI的靶向治疗具有重要意义。因此,本研究临床试验以瓣膜置换术患者为对象,观察心肌组织NF-κB转录活性及其下游炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间粘附分子-1(sICAM-1)及心肌肌钙蛋白I(cTn-Ⅰ)的血浆水平,探讨PHC的心肌保护作用。术中监测呼吸指数(RI)、氧合指数(OI)及肺动态顺应性(Cd),观察PHC对肺脏的保护作用。同时,建立内毒素诱导大鼠ALI模型,观察PHC对内毒素信号转导通路中CD14、TLR4、NF-κB mRNA表达及氧化应激的影响；进一步探讨PHC的作用机制及量效关系,为临床的合理应用提供参考。全文共分三部分。材料和方法择期行心脏双瓣瓣膜置换术患者60例,分为常规组(C组)、盐酸戊乙奎醚组1(P1组)、盐酸戊乙奎醚组2(P2组),每组20例。P1组、P2组盐酸戊乙奎醚剂量分别为0.05mg·kg-1和0.1mg·kg-1,均用生理盐水稀释至10ml,于切皮即刻经中心静脉缓慢注入,C组则给予等容量生理盐水。于体外循环开始前(T1)、主动脉阻断后30min(T2)及主动脉开放后30min(T3)取右心耳组织,观察NF-κB转录活性和心肌组织形态学改变。并分别于静脉注射PHC前(T1)、主动脉阻断后30 min(T2)、主动脉开放后30min(T3)、4h(T4)、24h(T5)抽取桡动脉血,检测血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间粘附分子-1(sICAM-1)及心肌肌钙蛋白I(cTn-I)水平。并记录上述各时间点的MAP、CVP、HR。试验对象、试验分组以及给药方法同第一部分。取第一部分各时间点采集的桡动脉血1ml做血气分析,记录PaCO2和PaO2值,并记录各时间点的吸入氧浓度(FiO2),以计算呼吸指数(RI)和氧合指数(OI)。并分别于气管插管后10min(静脉注射盐酸戊乙奎醚前)、30min、CPB前即刻、CPB后30min及60min记录呼吸机上潮气量(VT)、气道峰压(Pmax)及呼气末气道正压(PEEP)值,以计算肺动态顺应性(Cd)。32只雄性SD大鼠随机分为4组(n=8),对照组(C组)：腹腔和尾静脉均注射生理盐水1ml/kg;模型组(M组)：腹腔注射生理盐水1 ml/kg,30min后经尾静脉注射脂多糖(LPS)5mg/kg,盐酸戊乙奎醚低剂量治疗组(L组)、高剂量治疗组(H组)分别腹腔注射盐酸戊乙奎醚0.3mg/kg、1mg/kg,30min后经尾静脉注射LPS5mg/kg。模型制备后6h处死动物,取肺组织,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD14、TLR4及NF-κB mRNA的表达,ELISA法测定肺组织和血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量；分光光度计法检测肺组织和(或)血清中髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活力；测定肺组织湿/干重比(W/D)及含水量；光镜下观察肺组织形态学变化,透射电镜下观察肺组织超微结构的变化。结果1.1 C组患者心肌组织部分区域细胞肿胀、心肌纤维横纹模糊不清；心肌细胞间可见嗜中性粒细胞浸润。而P1、P2组心肌组织损伤较轻,心肌细胞间仅见少量嗜中性粒细胞浸润。1.2三组患者心肌细胞NF-κB转录活性于T2、T3时较CPB前明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。盐酸戊乙奎醚能显著降低T2、T3时点的心肌细胞NF-κB转录活性(P<0.05),但P1与P2两组间差异无统计学意义(P>0.05)。1.3三组患者血浆TNF-α水平在T3-Ts时点较静脉注射PHC前明显升高(P<0.01),P1、P2组血浆TNF-α水平较C组显著降低(P<0.05),但P1、P2两组间差异无统计学意义(P>0.05)。1.4三组患者血浆sIC AM-1水平在T3-Ts时点较静脉注射PHC前明显升高(P<0.01),P1、P2组血浆sIC AM-1水平较C组显著降低(P<0.05),但P1、P2两组间差异无统计学意义(P>0.05)。1.5三组患者血浆cTn-I水平在T2-Ts时点较静脉注射PHC前明显升高(P<0.01),P1、P2组血浆cTn-I水平较C组显著降低(P<0.05),但P1、P2两组间差异无统计学意义(P>0.05)。2.1 P1、P2组RI在T1时与C组相比较差异无统计学意义(P>0.05)；在T2-T5时间段,与C组相比较,P1组和P2组的RI显著低于C组,差异有统计学意义(P<0.01),而P1与P2组之间差异无统计学意义(P>0.05)。2.2 P1、P2组OI在T1时与C组相比较差异无统计学意义(P>0.05)；在T2-T5时间段,与C组相比较,P1组和P2组的OI显著高于C组,差异有统计学意义(P<0.01),而P1与P2组之间差异无统计学意义(P>0.05)。2.3 P1、P2组Cd在气管插管后10min与C组相比较差异无统计学意义(P>0.05)；在气管插管后30min以及CPB前后各时间点,与C组相比较,P1组和P2组的Cd显著高于C组,差异有统计学意义(P<0.01),而P1与P2组之间差异无统计学意义(P>0.05)。3.1大鼠肺组织中CD14、TLR4 mRNA表达与C组相比,M组、L组、H组大鼠肺组织中CD14、TLR4 mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)；与M组相比,L组及H组大鼠肺组织中CD14、TLR4 mRNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),但L组和H组两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.2大鼠肺组织中NF-κBmRNA表达与C组相比,M组、L组、H组大鼠肺组织中NF-κBmRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)；与M组相比,L组及H组大鼠肺组织中NF-κBmRNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),同时L组和H组两组间比较,差异亦有统计学意义(P<0.05)。3.3大鼠肺组织和血清中TNF-a含量与C组相比,M组、L组、H组大鼠肺组织和血清中TNF-a含量增加,差异有统计学意义(P<0.05)；与M组相比,L组及H组大鼠肺组织中TNF-a含量降低,差异有统计学意义(P<0.05),同时L组和H组两组间比较,差异亦有统计学意义(P<0.05)。3.4大鼠肺组织中MPO活性与C组相比,M组、L组、H组大鼠肺组织中MPO活性增加,差异有统计学意义(P<0.05)；与M组相比,L组及H组大鼠肺组织中MPO活性降低,差异有统计学意义(P<0.05),同时L组和H组两组间比较,差异亦有统计学意义(P<0.05)。3.5大鼠肺组织和血清中MDA含量与C组相比,M组、L组、H组大鼠肺组织和血清中MDA含量增加,差异有统计学意义(P<0.05)；与M组相比,L组及H组大鼠肺组织和血清中MDA含量降低,差异有统计学意义(P<0.05),同时L组和H组两组间比较,差异亦有统计学意义(P<0.05)。3.6大鼠肺组织中和血清中SOD活力与C组相比,M组、L组、H组大鼠肺组织和血清中SOD活力降低,差异有统计学意义(P<0.05)；与M组相比,L组及H组大鼠肺组织中和血清中SOD活力升高,差异有统计学意义P<0.05),同时L组和H组两组间比较,H组SOD活力升高,差异亦有统计学意义(P<0.05)。3.7大鼠血清中LDH活力与C组相比,M组、L组、H组大鼠血清中LDH活力增加,差异有统计学意义(P<0.05)；与M组相比,L组及H组大鼠血清中LDH活力降低,差异有统计学意义(P<0.05),同时L组和H组两组间比较,H组血清中LDH活力降低,差异亦有统计学意义(P<0.05)。3.8盐酸戊乙奎醚对急性肺损伤大鼠肺W/D值及肺含水量影响与C组相比,M组、L组、H组大鼠肺W/D值及肺含水量增加,差异有统计学意义(P<0.05)；与M组相比,L组及H组大鼠肺W/D值及肺含水量降低,差异有统计学意义(P<0.05),同时L组和H组两组间比较,H组大鼠肺W/D值及肺含水量降低,差异亦有统计学意义(P<0.05)。3.9盐酸戊乙奎醚对肺组织病理改变的影响光镜及电镜观察,C组肺组织结构正常,M组肺组织结构严重损伤,L组及H组肺组织损伤较M组减轻,同时L组和H组两组间比较,H组大鼠肺组织损伤较L组减轻。结论1.体外循环介导的全身炎症反应可引起心肌细胞NF-κB转录活性、血浆TNF-α、sICAM-1及cTn-I水平升高,盐酸戊乙奎醚可以通过抑制全身炎症反应减轻心肌损伤,对体外循环下瓣膜置换术患者的心肌具有保护作用。2.盐酸戊乙奎醚可明显降低瓣膜置换术患者RI、升高OI及Cd,改善肺功能状态,具有肺保护作用。3.盐酸戊乙奎醚可抑制内毒素信号转导通路中CD14、TLR4及NF-κB mRNA表达,降低TNF-α、MPO、MDA及LDH含量,升高SOD活力,减轻内毒素诱导的大鼠急性肺损伤。