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目的脂溢性脱发(SA)是临床最为常见的脱发性疾病。现代医学认为其是一种雄激素依赖的常染色体显性多基因遗传性秃发,雄激素过多或对雄激素敏感增加是该病发生的主要因素,SA的发生与睾酮(T)及其代谢产物二氢睾酮(DHT)和雄激素受体(AR)的水平增高直接相关,而5α-还原酶(5α-R)在其中起到重要作用,另外长期精神紧张、饮食失调、心理失衡及病菌感染为诱发或加重本病的重要因素。流行病学调查显示,白种人中50岁男性SA发病率可达50%以上,在我国约为21.3%。目前市场上充斥着许多合成的留体和非留体5α-R抑制剂,然而这些合成抑制剂往往都有很多不良反应,难以满足广大患者的需求。中医认为脱发的形成与肝肾不足、血气虚弱有关,中医多从养血活血、补肝益肾上进行治疗。许多传统中药具有补肝肾、益精血、凉血活血及乌须发等功效,常用于脱发病及白发病。例如:蒸首乌、当归养血益精;侧柏叶、旱莲草凉血乌须而黑发。现代研究发现许多中药复方或单方对毛囊、毛发生长都具有促进作用,中药防治SA也具有不同于西药的性质温和、副作用少等优点,但其治疗的靶点不明确,作用机理也有待进一步研究。本研究以中医对脱发的认识为依据,借助现代医学对脂溢性脱发的认识,即5α-R是治疗SA的有效靶点,结合课题组前期的研究结果,并通过建立体外筛选平台从具有补肝肾、益精血、凉血活血及乌须发的中药中筛选出可抑制5α-R活性的中药;另一方面,通过体内实验评价中药5α-R抑制剂对C57小鼠毛发生长的影响,并进行机制探讨,明确传统中药治疗SA的效果与5α-R的关系。本研究将阐明中草药治疗脂溢性脱发的机理,为新一代药效物质基础明确的SA健康品的研究开发奠定基础,也为国内外SA患者带来福音。方法1.基于高效液相色谱法(HPLC),建立抑制5α-R抑制剂体外筛选模型,从雄性大鼠附睾组织中提取Ⅱ型5α-R,与底物T以及供氢体NADPH共同组成一种微量的酶促反应体系。采用HPLC法测定反应前后T含量的变化,并以此来判断5α-R的活性。非那雄胺为阳性对照药;2.在已经建立的体外筛选模型的基础上,考察不同浓度中药提取物对5α-R活性的影响;3.以松香/石蜡混合物(1:1)脱毛法诱导C57小鼠毛发生长期,脱毛第2天,小鼠背部涂抹0.05%的睾酮溶液,30min后涂抹相应的药物,连续28d。每天观察各组小鼠拔毛部位皮肤颜色变化及被毛生长情况,每2日进行毛发生长评分;HE染色观察毛囊形态及数量,并参照Muller-Rover的毛囊形态学分期依据对毛囊进行分期评分;4.采用酶联免疫法(ELISA)检测各组小鼠血清及皮肤组织T、DHT及E2的含量;免疫荧光法检测脱毛部位皮肤组织Ⅱ型5α-R表达情况,Image J软件测定荧光密度,并进行半定量分析;Pearson相关分析5α-R表达与皮肤组织DHT水平的关系。结果1.本研究建立了 HPLC法5α-R抑制剂体外筛选平台,色谱条件为色谱柱:北京迪马DiamonsilTM C18(250mm×4.6mm,5μm)不锈钢柱;流动相:甲醇/水 70/30(V/V),柱温:室温;检测波长:242nm;流速为:1.0mL/min;进样体积:20μL;酶促反应体系条件底物T浓度1000μmol/L,NADPH浓度1mmol/L,粗酶浓度0.7mg/mL,反应温度37℃,反应时间30min;非那雄胺可呈剂量依赖性抑制5α-R活性,抑制率高达 83.67%,IC50 212nmol/L;2.侧柏叶、何首乌、锁阳、灵芝、红花、墨旱莲、枸杞子等均可以显著抑制5α-R活性(P<0.01),在药物浓度0.02-2.5mg/mL范围内抑制率随剂量的增大而增加;3.与模型组比较,高、低剂量侧柏叶醇提物均可显著缩短小鼠皮肤由粉红变黑色的时间及皮肤长出毛的时间(P<0.01),可显著促进小鼠毛发生长;与模型组比较,高、低剂量侧柏叶醇提物均可显著降低小鼠毛囊形态分期评分(P<0.01),显著增加单位视野内毛囊数量(P<0.01);4.与模型组比较,侧柏叶高、低剂量组小鼠血清T、DHT及E2含量均无显著性差异(P>0.05),皮肤组织DHT水平显著性降低(P<0.01);与模型组比较,侧柏叶高、低剂量组平均荧光强度显著降低(P<0.01)。皮肤组织5α-R的表达强度与局部DHT水平呈正相关(Pearson相关系数r = 0.837,P<0.01)。结论1.本研究建立了一种稳定的、可复制的5α-R抑制剂体外筛选平台,可用于中药5α-R抑制剂的筛选;2.本研究筛选出侧柏叶、何首乌、锁阳、灵芝、红花、墨旱莲、枸杞子等具有显著活性的中药5α-R抑制剂,在药物浓度0.02-2.5mg/mL范围内抑制率随剂量的增大而增加;3.侧柏叶醇提物可促进小鼠毛发由休止期进入生长期,促进毛发生长;可促进毛囊生长,抑制毛囊由生长期进入休止期;4.涂抹睾酮后,小鼠皮肤组织DHT水平及5α-R表达增加且呈正相关;经过侧柏叶的作用后,DHT水平及5α-R表达均下调。