骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cell, MSC)是一种从成年个体骨髓中分离得到,具有较强的增殖能力和多方向分化潜能,可分化为骨骼组织、软骨组织和脂肪组织细胞,并能转化为肌原细胞、神经细胞和肝细胞等多种组织细胞的多能干细胞,其在组织损伤修复甚至再生中发挥了重要作用。有研究表明,体内移植人源性MSC后,直接转化为受损组织细胞的数量较少,且这种直接的组织细胞转化很难促进组织修复或再生,但是MSC可通过自身分泌或促进受损组织分泌活性因子以改变组织微环境,发挥组织修复作用。美国亨利福特医院神经科学研究室Dr Chopp研究小组,在近二十年间对MSC治疗缺血性脑卒中的机制进行了深入研究发现,MSC在治疗脑卒中过程中,通过促进突触重塑、神经再生和血管再生过程发挥明显治疗作用,可以促进神经功能的部分恢复,治疗机制包括MSC抑制星形胶质细胞分泌抑制神经元生长、伸展和移行的抑制性蛋白,促进脑组织尤其是星形胶质细胞分泌神经营养因子、多种生长因子和趋化因子,易化神经损伤修复过程。并且发现组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, tPA)是MSC治疗脑卒中的关键调节因子,MSC治疗后,受损脑组织内内源性tPA表达量及活性均明显升高,它与MSC引起的神经功能恢复密切相关。Sonic hedgehog (Shh)的信号转导通路相对保守,在器官形态发生过程中具有重要作用,并参与多种神经损伤修复和神经再生的过程,体外试验结果显示,MSC可增加星形胶质细胞中Shh表达,Shh信号转导通路激活后引起tPA升高、组织纤溶酶原激活物抑制剂1(tissue plasminogen activator inhibitor1, PAI-1)降低,但MSC在体内是通过哪些信号通路调节tPA的表达与活性升高尚无相关研究,因此MSC引起受损脑组织tPA升高的作用机制仍不清楚。基于上述体内外实验研究结果,本研究提出了Shh信号通路参与MSC引起脑实质细胞tPA表达升高而治疗脑卒中的假设,采用小鼠MCAo模型,评价MSC治疗组、Shh信号通路阻断剂Cyclopamine组以及Cyclopamine同MSC合用组对小鼠神经功能、神经轴突再生、突触重塑等的多方面影响,以及对局部缺血脑组织中脑实质细胞(包括星形胶质细胞和神经元)Shh和tPA蛋白及基因表达的影响,以求剖析Shh与tPA之间的关系；本研究同时观察了给予MCAo小鼠侧脑室内注射重组Shh蛋白及体外应用重组Shh蛋白处理原代培养神经元后,对神经再生、tPA和PAI-1蛋白表达的影响。旨在寻找MSC治疗缺血性脑卒中过程中促进tPA表达及活性升高的信号途径；探讨Shh信号通路在MSC治疗脑卒中过程中的作用及机制；并确定MSC与脑实质细胞间相互作用中Shh的细胞来源,即来源于外源性MSC和／或脑实质细胞内源性分泌所致；剖析Shh信号通路与tPA改变之间的关系。采用小鼠MCAo模型,分别给予动物单次静脉1×106个人源性MSC、腹腔注射Cyclopamine或MSC与Cyclopamine联合应用,神经功能评价发现,MSC治疗组小鼠在MCAo后7天和14天改良神经功能缺损评价(mNSS)和足错步评分有明显改善(p<0.05,0.01),Shh信号通路阻断剂Cyclopamine与MSC联合应用或Cyclopamine单独使用后对神经功能缺损无明显作用。MCAo术后14天剖杀动物,脑组织样本经Bielshowschy silver和Fast blue双重化学染色、突触囊泡蛋白(Synaptophysin)免疫荧光染色及电镜检测突触密度,结果显示,MSC治疗后,MCAo小鼠脑缺血局部组织神经纤维重建明显改善,突触囊泡蛋白阳性区显著升高,突触密度明显升高；而MSC和Cyclopamine联用及Cyclopamine单独使用后这些作用均消失。以上结果说明,MSC治疗可以在一定程度增加脑缺血后局部组织突触密度,但这种作可被Shh信号通路阻断剂Cyclopamine拮抗。为观察脑实质细胞中星形胶质细胞和神经元在治疗后tPA和Shh表达变化,分别选用两种神经细胞的标记物,胶质酸性纤维蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)和神经元特异性核蛋白(Neuronal specific nuclear protein, NeuN)分别与tPA和Shh进行免疫荧光双染色,即tPA/GFAP、tPA/NeuN、Shh/GFAP和Shh/NeuN,(?)明确tPA和Shh的共表达情况,结果显示,MSC治疗可引起星形胶质细胞和神经元表达tPA和Shh的量明显增加,这种现象在MSC联用Cyclopamine后消失,单用Cyclopamine后小鼠脑组织Shh表达量与对照组无明显差别。通过western blot检测Shh信号转导通路效应分子Glil在缺血脑组织中的表达,结果发现单用Cyclopamine, Gli1在脑组织中表达明显降低,MSC治疗可引起效应分子Gill表达升高,Cyclopamine与MSC联合使用后,MSC升高Glil的作用被阻断。采用激光显微切割技术专一捕获脑缺血周围区星形胶质细胞,并通过Realtime-PCR技术分析其Shh和tPA mRNA表达发现,MSC治疗组可使缺血脑组织星形胶质细胞中Shh mRNA和tPA mRNA表达水平均增高,Cyclopamine单独使用对Shh和tPA mRNA表达均无影响,而MSC与cyclopamine联用后,Shh mRNA表达升高未受影响；但tPAmRNA表达升高作用被逆转。因脑实质细胞在MSC作用下,Shh表达升高,未确定升高的Shh是否为外源性MSC在脑组织局部释放所致,分别采用Western blot和Realtime PCR方法检测了MSC细胞中Shh在蛋白水平及基因水平的表达情况。结果显示,相对于星形胶质细胞和脑组织中Shh蛋白表达比较丰富明显,未能在MSC细胞中检测到Shh蛋白表达,说明MSC中Shh在蛋白水平表达极低。经Realtime-PCR检测发现,MSC中Shh的基因表达量仅相当于星形胶质细胞的万分之二(0.000204倍),而原代培养神经元中Shh在基因水平的表达与星形胶质细胞相当,说明在MSC中Shh在基因水平表达极低。为进一步确证Shh对缺血受损脑组织及体外培养神经元的作用,首先体内给予MCAo小鼠侧脑室内连续7天输注外源性Shh(0.01%Shh、100μl),采用激光扫描共聚焦显微成像技术,在MCAo术后8天及28天剖杀动物,通过免疫荧光染色SMI-31和SMI-32,标记树突和成熟神经元,通过分析软件三维立体成像并测量单位体积内神经轴索长度,以及western blot检测局部脑组织PA和PAl-1表达,给予Shh治疗MCAo小鼠在MCAo术后28天其缺血局部脑组织SMI-31+和SMI-32+(?)经丝阳性神经元长度显著增加(p<0.001),表明Shh治疗可明显增强局部脑缺血组织神经元的重塑;MCAo术后8天外源性Shh治疗组脑组织缺血周围区tPA表达升高、PAl-1表达降低(p<0.05),说明Shh可以直接增加tPA蛋白表达,或者通过抑制PAl-1表达间接提高tPA表达。体外实验中,通过MSC与星形胶质细胞、原代神经元三种细胞共培养,使用ELISA试剂盒检测各神经元培养上清中Shh蛋白浓度,结果显示,在原代神经元与星形胶质细胞及MSC共培养体系中,与未经任何处理或Cyclopamine作用后的神经元比较,其培养上清中Shh浓度明显升高,(P<0.01)；另通过神经元p-Ⅲ微管蛋白免疫荧光染色,测量Shh作用后神经元突起长度和数量的变化,结果显示,重组Shh作用于正常或经2小时OGD培养的原代神经元后,其神经元突起数目及长度明显升高,而在与正常或OGD星形胶质细胞与MSC、原代神经元共培养后也能观察到相同结果,与此相反,经Cyclopamine作用后,神经元突起数目和长度均降低；结合两种体外结果分析,提示Shh含量与神经元突起的数目及长度存在一定相关性。综上所述提示：MSC在治疗缺血性脑卒过程中,可促进动物神经功能缺损的恢复；MSC改善缺血性脑卒中动物神经功能同时,可引起脑实质细胞中星形胶质细胞和神经元tPA表达升高；Shh信号通路在MSC治疗脑卒中过程中,发挥重要作用,其直接介导MSC引起的神经功能缺损改善,MSC治疗首先引起Shh基因表达升高,继而引起Shh蛋白表达升高；Shh信号通路为tPA上游信号通路。应用MSC后,可引起Shh信号通路加强,并直接引起tPA基因和蛋白表达升高。MSC治疗所引起的脑实质细胞中Shh表达升高,是直接来源于实质细胞产生Shh增多,而并非由外源性MSC在脑组织局部释放Shh增多所致。