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研究背景慢性髓性白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是一种严重影响人类健康的恶性血液系统疾病。Ph染色体上的BCR-ABL1融合基因编码的融合蛋白具有极强酪氨酸激酶活性,能够诱导CML疾病的发生。目前,酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitors,TKIs）靶向药的问世为CML患者带来了长期生存的希望,特别是以伊马替尼（Imatinib,IM）为代表的TKIs可显著提高CML治疗效率并延长慢性期患者的长期生存。随着TKIs的广泛应用,仍有部分患者在治疗过程中会出现IM耐药,甚至进展至加速急变期,预后极差。因此,研究CML的发病及耐药机制并探寻其逆转耐药对策尤为重要。转录因子ZHX2（Zinc-finger and homeoboxes 2）作为新近发现的肿瘤抑制因子,可通过抑制细胞增殖、迁移以及耐药相关基因表达,从而阻止肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）等多种实体肿瘤的发生发展。我们前期研究发现,转录抑制因子ZHX2在CML患者中表达水平降低,且ZHX2在TKIs耐药的CML患者中表达更低,说明ZHX2在CML发病及TKIs耐药中发挥重要作用。目前ZHX2分子在CML发生发展中具体作用机制及其对BCR-ABL1激酶通路的影响尚不明确,仍有待进一步研究。研究目的探讨ZHX2表达水平与CML疾病特征、临床分期、TKIs治疗效果等之间的相关性,明确ZHX2对CML细胞增殖凋亡、TKIs药物敏感性等生物学行为的影响,进一步验证ZHX2对BCR-ABL1激酶通路相关分子的表达调控作用。研究预期目标将揭示ZHX2分子在CML的发生发展中具体作用及机制,为解决CML治疗中分子靶向治疗提供新思路。研究方法1.研究对象选择及标本采集:收取25名成人CML初诊慢性期患者,15名获得完全分子学缓解患者（1年BCR-ABL1水平达MR4.5）,23名TKIs治疗失败患者（1年BCR-ABL1水平未获得MR）,4名CML急变期患者,同时5例身体健康志愿者为正常对照组。采集CML患者组与健康对照组骨髓、外周血标本,采用人血淋巴细胞分离液法收取单个核细胞冻存备用。2.实时定量逆转录聚合酶链反应（Real time RT-PCR）法检测原代CML细胞中ZHX2表达:应用Trizol法提取CML原代细胞总RNA,将总RNA通过M-MLV逆转录酶逆转录为cDNA,采用Real-time RT-PCR技术检测CML患者和正常对照组原代细胞中ZHX2的mRNA表达水平,以GAPDH为内参。3.Spearsman秩相关分析ZHX2表达与CML疾病特征、临床分期、TKIs治疗效果的关系,Mann-Whitney U检验比较CML患者初诊、分子学完全缓解、TKIs药物治疗失败及急变期的四种疾病状态时ZHX2 mRNA水平表达差异。4.Real time RT-PCR、Western blot法检测IM敏感株及耐药CML细胞株中ZHX2的表达:应用Real time RT-PCR、Western blot法从mRNA/蛋白水平分析比较K562、K562/G01细胞株中ZHX2的表达差异。5.包装携带ZHX2过表达载体的质粒及慢病毒转染CML细胞株:应用RPMI-1640培养基培养人CML细胞IM敏感株K562和IM耐药株K562/G01;应用pcZHX2-HA tag质粒借助工具细胞293T作为宿主完成慢病毒的包装过程;将包装好的LV-ZHX2过表达病毒、ZHX2-CON对照病毒感染K562、K562/G01细胞（K562/G01细胞在IM 4umol/L诱导1周撤药2周后应用）,3天后应用免疫荧光显微镜观察评估病毒转染效率,用2ug/ml嘌呤霉素处理转染细胞,并筛选得到100%稳定感染的ZHX2过表达CML细胞株。因ZHX2在CML中本身低表达状态,未进行ZHX2下调病毒转染。6.Real time RT-PCR、Western blot法验证病毒感染CML细胞株中ZHX2的高表达:应用Real time RT-PCR法、Western blot法从mRNA/蛋白水平检测病毒感染稳筛后的ZHX2表达水平。7.CCK-8法检测CML细胞增殖:应用CCK-8方法检测过表达ZHX2对CML耐药株和敏感株细胞增殖的影响。8.CCK-8法检验CML细胞对TKI药物敏感性:将IM按梯度稀释,按药物浓度梯度分别处理ZHX2上调组及其对照组,培养48小时后,应用CCK-8法检测CML细胞对IM的敏感性差异。9.流式细胞学技术检测CML细胞凋亡:分别选取较低浓度IM处理ZHX2上调及其对照组,培养48小时后,根据Annexin VAPC/7-AAD试剂盒指示进行双染色后,流式细胞仪上机检测处理后的CML细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率。10.Western blot法检测ZHX2过表达对BCR-ABL1激酶活性蛋白表达的影响:应用Western blot法从蛋白水平检测上调ZHX2后CML细胞与对照组中BCR-ABL1激酶活性蛋白分子P-Stat5、P-Tyr、P-Crk1表达差异。11.Western blot法检测BCR-ABL1激酶活性蛋白过表达对ZHX2表达的影响:应用Western blot法检测BCR-ABL1P210阳性的细胞株BaF3P210以及T3151突变阳性细胞系BaF3P210 T3151中ZHX2的表达差异。研究结果1.初诊CML患者骨髓单个核细胞中ZHX2分子mRNA表达水平较正常对照组明显降低,说明ZHX2可能对CML发病至关重要。2.治疗效果良好达到分子学完全缓解CML患者中ZHX2分子mRNA表达水平明显高于CML初诊患者,且与正常对照组表达无明显差异;而治疗失败的CML患者体内ZHX2表达水平也高于CML初诊患者,但未恢复至正常对照组ZHX2表达水平;而急变期CML患者体内ZHX2的表达与初诊慢性期患者无明显差异,提示ZHX2表达水平可能与TKIs疗效关系密切。3.与IM敏感的CML细胞相比,IM耐药的CML细胞中ZHX2分子mRNA及蛋白表达水平明显降低。4.携带ZHX2表达载体的慢病毒可有效上调CML细胞株K562、K562/G01中ZHX2表达水平（因ZHX2在CML细胞株中本身表达较低,未下调ZHX2表达水平）。5.ZHX2表达上调可有效抑制CML细胞的增殖速率,延长倍增时间;能明显提高CML细胞对IM的敏感性,并增加IM诱导的细胞凋亡。6.上调ZHX2表达可使CML细胞BCR-ABL1激酶活性蛋白分子P-Stat5、P-Tyr、P-Crkl表达减弱,但ZHX2在BCR-ABL1激酶活性不同的细胞株中表达无明显差异,说明ZHX2可能通过调控BCR-ABL1激酶活性参与CML发病及TKIs耐药。研究结论1.在初诊CML患者中ZHX2分子呈低表达状态:TKIs治疗效果越好,ZHX2表达水平越高,提示ZHX2分子可能与CML的发病及耐药相关,极有可能成为评估CML患者预后的有效指标。2.ZHX2分子过表达可有效抑制CML细胞增殖速度,增强CML细胞对化疗药物的敏感性及其诱导的细胞凋亡,表明ZHX2分子在CML的发生发展及TKIs耐药中发挥重要的抑癌基因作用,为CML逆转耐药提供新的临床思路和方向。3.ZHX2分子过表达可改变BCR-ABL1融合蛋白调控的下游分子表达,其可能通过调控BCR/ABL1激酶活性蛋白通路,从而影响CML细胞增殖、凋亡及其对TKIs药物的敏感性。