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第一部分FcαRI在儿童过敏性紫癜体内表达及其意义目的:观察急性期过敏性紫癜(HSP)患儿Ig A Fc受体FcαRI在外周血及皮肤组织中的表达,了解血清可溶性s FcαRI-Ig A和皮肤组织中FcαRI水平的相关性;同时探讨FcαRI与炎症相关因子的关系及其在儿童急性期HSP发病中的作用。方法:采用Sandwich固相ELISA法、免疫组化及Westernblot等方法,分别检测FcαRI在HSP患儿血清和皮损组织中的表达和分布。直接免疫荧光检测皮损组织中Ig A、C3、Fib的沉积;ELISA检测患儿血清FcαRI相关炎症细胞因子IL-6、TNF-α的水平。结果:1、HSP皮肤组织FcαRI的免疫组化染色显示,HSP各组皮肤组织均有明显FcαRI沉积,强阳性染色见于基底层、颗粒层,皮肤附属器和汗腺导管,中性粒细胞也可见阳性表达,角质层未见FcαRI表达。与对照组比较,HSP各组皮肤组织FcαRI组化染色强度明显增加;急性期HSP患儿皮损处FcαRI免疫组化HSCORE评分平均为205分,显著高于正常对照组(p<0.01)。western blot条带灰度值分析HSP患儿组FcαRI蛋白表达较正常对照显著增加,而HSP组与HSPN组之间无显著性差异(p>0.05)。2、HSP组和HSPN组急性期血清可溶性s FcαRI-Ig A水平较正常对照组明显增高(p<0.01),而HSP组和HSPN组之间无明显统计学差异(p>0.05),血清s FcαRI-Ig A水平与皮肤组织FcαRI表达水平呈正相关(r=0.51,p=0.02)。急性期HSP血清IL-6水平较正常对照组增高(p<0.01),HSP组和HSPN组之间无统计学意义(p>0.05),急性期HSP患儿PBMC上清中TNF-ɑ水平高于正常对照组(p<0.05),HSPN组TNF-ɑ水平高于HSP组(p<0.05)。结论:Ig A受体FcαRI在HSP系统性血管炎症中有重要作用,急性期HSP患儿血清s FcαRI-Ig A水平明显增高,且与皮损中的表达呈正相关,FcαRI相关促炎细胞因子IL-6、TNF-α水平明显增高,FcαRI直接参与了HSP免疫发病过程。第二部分:HSP患儿中性粒细胞活化对血管内皮细胞的影响目的:研究HSP患儿中性粒细胞活化对血管内皮细胞凋亡的影响及促炎细胞因子IL-8、TNF-ɑ在其中的作用,并探讨FcαRI在不同类型配体Ig A作用下对中性粒细胞活化致血管内皮细胞损伤的调控效应。方法:采用流式检测HSP患儿外周血中性粒细胞早期活化标志分子CD11b;q PCR检测外周血中性粒细胞FcαRI m RNA的表达,Western blot检测其蛋白的水平;细胞共培养技术构建HSP患儿中性粒细胞-血管内皮细胞炎症模型,分别加入m Ig A、p Ig A干预,流式观察m Ig A、p Ig A作用下HUVEC的凋亡;ELISA检测细胞上清IL-8、TNF-α水平。结果:1、HSP组中性粒细胞FcαRI的m RNA表达与正常对照组比较无统计学差异(P=0.98),FcαRI蛋白表达较正常对照显著降低(p<0.05),western blot条带灰度值分析显示HSP患儿较正常对照组降低,急性期HSP患儿中性粒细胞CD11b的平均荧光强度(MFI)显著高于正常对照组(p<0.01)。2、HUVEC+HSP Neu+p Ig A组血管内皮细胞平均凋亡率达63.99%,较HUVEC+HSP Neu+m Ig A组(27.07%)显著增高(p<0.01),HUVEC+HSP Neu+p Ig A组血管内皮细胞平均凋亡率高于HUVEC+HSP Neu+PBS组(34.9%)(p=0.01),HUVEC+HSP Neu+m Ig A组凋亡率低于HUVEC+HSP Neu+PBS组,但无统计学差异(p>0.05)。3、HUVEC+HSP Neu+p Ig A组细胞上清IL-8,TNF-α的水平显著高于HUVEC+HSP Neu+m Ig A组(p<0.01,p<0.01),较HUVEC+HSP Neu+PBS组也增高(p<0.05,p<0.05);HUVEC+HSP Neu+m Ig A组细胞上清IL-8,TNF-α水平较HUVEC+HSP Neu+PBS组降低,但无统计学意义(p>0.05,p>0.05)。结论:1、急性期HSP中性粒细胞FcαRI在转录水平正常,但在蛋白水平较正常对照降低。中性粒细胞活化早期表达的粘附分子CD11b增高,可促进中性粒细胞向血管内皮细胞的粘附和迁移。2、急性期HSP中性粒细胞可诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC发生凋亡,p Ig A对中性粒细胞介导的HUVEC凋亡具有促炎效应;m Ig A对中性粒细胞介导的血管内皮细胞凋亡可能具有抑制效应。p Ig A可促进血管内皮细胞炎性细胞因子IL-8,TNF-α的分泌,m Ig A对IL-8,TNF-α的分泌可能具有抑制作用。第三部分:Ig A/FcαRI介导过敏性紫癜中性粒细胞-血管内皮细胞损伤的分子机制目的:进一步研究Ig A/FcαRI介导HSP中性粒细胞活化损伤血管内皮细胞的分子机制,并探讨FcαRI的单克隆抗体MIP8a阻断后,不同类型配体Ig A对中性粒细胞Syk、PI3K信号通路的调控作用。方法:细胞共培养技术构建中性粒细胞-血管内皮细胞炎症模型,不同种类配体Ig A及FcαRI单克隆抗体MIP8a干预后,q PCR检测中性粒细胞Syk、PI3K m RNA的表达,Westernblot检测Syk、p-Syk、PI3K、p-PI3K蛋白的水平;流式检测血管内皮细胞的凋亡率。结果:1、p Ig A各组中性粒细胞Syk、PI3K m RNA表达随MIP8a浓度增大而降低,MIP8a 0ug组显著高于空白对照组(p<0.01),MIP8a 5ug组和10ug组均低于0ug组(p<0.05,p<0.05),而3ug组与0ug组无统计学差异(p>0.05),m Ig A各不同浓度组中性粒细胞中Syk、PI3K的m RNA表达随MIP8a浓度增高而增高(p<0.05)0ug与3ug之间无统计学差异(p>0.05)。2、随MIP8a浓度由0ug增加到10ug,p Ig A各组非磷酸化Syk和PI3K蛋白的水平较空白对照组无统计学差异(p>0.05),而磷酸化Syk(p-Syk)和磷酸化PI3K(p-PI3K)蛋白的水平则逐渐降低(p<0.01);在m Ig A组,随MIP8a浓度由0ug增加到10ug,p-Syk和p-PI3K蛋白的水平逐渐增高(p<0.01)。3、空白对照组模型HUVEC凋亡率为8.26%,p Ig A组MIP8a 0ug凋亡率达到73.63%,加入MIP8a 3ug,5ug,10ug后HUVEC凋亡率逐渐减少(p<0.01).m Ig A组随着MIP8a浓度由0ug增加到10ug,HUVEC凋亡率逐渐增加(p<0.01)。结论:胞内信号转导分子Syk、PI3K是中性粒细胞FcαRI活化的重要信号通路,p Ig A和m Ig A通过信号通路Syk、PI3K与FcαRI交联促进或抑制中性粒细胞活化,MIP8a能与Ig A竞争性结合受体Fc段从而发挥阻断作用,且该阻断作用随剂量依赖性。靶向干预Ig A/FcαRI能调控HSP中性粒细胞活化介导的血管内皮细胞凋亡。