青光眼是由视网膜神经节细胞,视乳头和视神经的凋亡导致视觉损伤的一类眼科疾病,是世界第二位致盲性疾病。青光眼的主要临床表现为高眼压,在众多导致眼压升高的因素中,小梁网的病变为重要原因之一,小梁网的变性和凋亡都会导致房水外排阻力的增加从而升高眼压。间隙连接是细胞膜上广泛存在的一种膜蛋白,为了证明间隙连接在正常房水外排中发挥着重要的功能,我们检测了不同的间隙连接蛋白压型在小梁网上的表达并证明了阻断间隙连接会导致小梁网房水外排受阻和眼压升高。自2016年诱导性多能干细胞iPSC技术出现以来,通过iPSC重塑小梁网成为一种潜在的治疗手段。我们前期研究证实源自iPSC的小梁网类似细胞(iPSC-TM)可重塑已退行或正在退行的小梁网,有效的缓解青光眼症状。然而,其作用机制并不明确,致使iPSC的临床应用进展缓慢。本研究从iPSC重塑小梁网的作用机制入手,证明iPSC-TM和小鼠小梁网之间的间隙连接对iPSC介导的组织重塑至关重要。此研究不仅明确了干细胞重塑小梁网的生物学本质,也为后期筛选关键促增殖因子提供了重要的实验证据。研究目的:探究间隙连接在正常小梁网中的表达情况,以及在房水外排和眼压维系中发挥的重要作用;探索间隙连接在iPSC来源的小梁网促进内源性小梁网细胞增殖中的关键作用。研究方法:利用RT-PCR,Western Blot和免疫荧光技术检测人类小梁网细胞上21种间隙连接蛋白的表达情况;前房注射间隙连接抑制剂FFA和CBX评价其对房水流畅系数和眼压的影响;通过条件培养基诱导分化iPSC得到小梁网类似细胞,并在体外建立与小梁网细胞的共培养模型。研究结果:RT-PCR,Western Blot和免疫荧光实验证明间隙连接在人的小梁网细胞和组织上高表达,在21种间隙连接蛋白中,GJA1,GJA8,GJB6,GJC1的表达量相对较高;正常小鼠前房注射CBX和FFA可以降低房水外排,升高眼压;诱导分化14天后,对磁珠分选得到的iPSC-TM进行RT-PCR和免疫荧光鉴定,结果显示TIMP3和LAMA4等小梁网相关生物标记物高表达,Nanog和SOX2等干细胞相关生物标记物低表达甚至不表达,证实iPSC来源的小梁网细胞具有与小梁网细胞相类似的特性;免疫荧光实验证明在小鼠小梁网细胞和iPSC-TM上均表达间隙连接蛋白GJA1和GJC1,共培养后,在两种细胞连接处高表达;在共培养体系中,Cell Tracker Red标记的小鼠小梁网细胞,与iPSC-TM共培养24 h和48 h后,共培组小鼠小梁网细胞数目显著高于对照组;经过间隙连接的抑制剂——CBX和FFA处理后,iPSC-TM的促增殖作用被显著抑制;Dye Transfer实验表明iPSC-TM与小鼠小梁网细胞之间存在着钙离子的传递。研究结论:1.在人类小梁网细胞中高表达4种间隙连接蛋白,GJA1,GJA8,GJB6和GJC1,其中表达量最高的是GJA1和GJA8。2.间隙连接在小梁网外排房水和调控眼压过程中发挥着重要作用。3.靶向间隙连接可以成为缓解青光眼中高眼压症状的一种治疗手段。4.iPSC通过条件培养基诱导分化可以得到小梁网类似细胞,它在基因水平,蛋白水平以及功能方面都与小梁网十分相似。5.干细胞来源的小梁网细胞可能是通过间隙连接促进内源性小梁网细胞的增殖。