前言EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）属于癌病毒家族中疱疹病毒的γ亚家族，1964年由Epstein、Barr等成功地培养非洲恶性淋巴瘤的细胞并首先提取病毒颗粒。EBV呈球形，为双链DNA病毒，其直径约180nm，衣壳表面附有包膜，包膜上有糖蛋白。核心线型双股DNA，其长度为-184kbp。EBV与多种疾病有关，感染时可患传染性单核细胞增多症，另外与其相关的恶性肿瘤主要有Burkitt淋巴瘤，咽喉癌，胃癌，以及移植后淋巴瘤和免疫缺陷患者所患的淋巴瘤等等。1990年Burke首次报道了1例与EBV相关的胃癌。1991年Shibata检测出伴有大量淋巴细胞浸润的未分化胃癌中有EBV DNA。次年，他检测了没有大量淋巴细胞浸润的胃腺癌128例，其中22例含EBV DNA。同时在淋巴结、肺或肝的转移灶中也存在EBV DNA。应用ISH法对EBV进行定位，发现阳性检测例的癌细胞核内及核仁中几乎都有EBERs表达。1993年Tokunaga报道了日本人与EBV相关胃癌约占胃癌的6.9％，可发生于胃的各个部位及各种类型的胃癌中。这是最先认为EBV与胃癌相关的报道。但以上研究均未能肯定EBV在胃癌发生中的致癌作用。因为发现正常胃上皮细胞和浸润淋巴细胞中没有EBV DNA，并且胃正常粘膜上皮细胞不表达CD21。Oda等应用Southern杂交法检测具有淋巴细胞浸润的胃癌，发现了肿瘤细胞的克隆性增生和以一种附加体方式存在的EBV。提出感染发生在肿瘤转化之前，并与胃癌发生有关。Leoncini等也提出，如果恶性转化后癌细胞才开始表达CD21，那么在肠型胃癌的非典型增生期，细胞也可因受体改变表达CD21而感染DBV，继发含EBV的癌细胞克隆性增生。Levine从血清学角度证明癌细胞之EBV感染发生于癌变初期阶段或之前。EBV相关胃癌在北美发病率为16％，日本7％～11％，中国（沈阳市）3.4％。与普通胃癌相比发病年龄无差异，男女比例3：1。病理学上，EBV相关胃癌在胃上部特别是贲门部癌的阳性率为最高。EBV的潜伏感染主要有3种类型。Ⅲ型潜伏感染主要为体外转化B细胞形成的LCLs（lymphoblastoid cell lines LCLs），体外培养的部分Butkitt淋巴瘤组织由来的细胞系，以及AIDS和脏器移植后的淋巴增殖症和淋巴瘤。该种潜伏感染的细胞表达所有EBV的6种核抗原（EBNA1，2，3A，3B，3C，LP），3种膜蛋白（LMP1，2A，2B），不被翻译成蛋白的小RNA（EBERs），以及BARTs。Ⅰ型和Ⅱ型潜伏感染则表达较少EBV基因。由于EBNA3s是杀伤性T细胞（CTL）的主要靶抗原，所以Ⅰ型和Ⅱ型的感染状态中不易被CTL攻击，病毒感染和宿主免疫形成微妙的平衡状态，使感染成立。胃癌呈Ⅰ型潜伏感染。只表达EBNA1，（EBERs），以及BARTs。EBV感染细胞是如何逃避细胞性免疫的，目前认为主要是通过C启动子（C promoter Cp）失活，从而使具有CTL免疫性的EBNA蛋白不能被转录。Cp失活的原因主要是由于调节转录蛋白的结合位点处CpG甲基化。EBV相关肿瘤的特异性治疗目前仍处于理论研究状态。一种方法是利用以EBNA1或LMP1为靶的核酸酶或反义寡核苷酸来抑制EBV阳性肿瘤细胞的生长。另外，基于大多数EBV阳性肿瘤（除免疫缺陷患者外）病毒均呈现严格的潜伏感染状态，而不表达免疫优势的ENBA3A，3B，3C。所以免疫治疗比较困难。除非有方法使解除Cp的甲基化，并开始启动转录。已有研究显示在Burkitt淋巴瘤细胞系中5-azacytidine可以挽救Cp使其去甲基化。EBV相关肿瘤的特异性治疗仍需新一步深入研究。本研究的目的是通过在体外建立EBV阳性胃癌细胞系，探索是否5-azacytidine可以使Cp去甲基化进一步探索用siRNA抑制DNA甲基化酶的表达使EBV Cp激活而对EBV相关胃癌的治疗有所帮助。材料和方法一、细胞培养胃癌细胞系AGS细胞，生长于10％的胎牛血清和10U／ml青霉素的Ham F-12培养液中，NUGC3细胞生长于10％的胎牛血清和10U／ml青霉素的DMEM培养液中，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内传代培养。EBV阳性AGS／xneo细胞克隆和NUGC3／EBV生长于10％的胎牛血清和10U／ml青霉素，G418 500ug／ml的Ham F-12或DMEM培养液中，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内传代培养。Akata／xneo是EBV阳性Burkitt淋巴瘤细胞系，生长于10％的胎牛血清和10U／ml青霉素，G418 700ug／ml的RPMI1640培养液中。P3HR1，MutuⅢ，Daudi均生长于10％的胎牛血清和10U／ml青霉素的RPMI1640培养液中。二、EBV阳性胃癌细胞系的建立采用cell to cell感染法。将用0.5％anti-human IgG诱导裂解感染的Akata细胞加入24小时前传代的胃癌细胞系AGS或NUGC3的培养皿中，继续培养2-3天。反复清洗去除残存的Akata细胞。1000细胞／孔铺至96孔板，G418 500ug／ml选择筛选EBV阳性克隆。三、免疫荧光染色法检测一定浓度的细胞抹片后晾干。检测EBV EBNA时用丙酮：甲醇=1：1混合液-20℃固定3分钟。一抗用人血清37℃反应40分钟，PBS洗片5分，风干后，二抗用FITC标识的抗人C3C补体37℃反应20分钟，PBS洗片10分钟，风干后荧光显微镜下观察。四、蛋白检测western blot按常规方法操作，样品为全细胞超声裂解产物，4×10⁵细胞裂解液上样8％分离胶SDS-PAGE蛋白电泳，电转硝酸纤维膜（PVDF）膜，行Western blot，即转膜成功后5％脱脂奶粉封闭，TBST洗膜后，加人血清一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜；加鼠抗人1：2000 HRP标记二抗，室温孵育30分，TBST洗膜，混合化学发光试剂1和试剂2加至膜上1min，最后X片显影。相应抗体见附录2。五RNA检测RT-PCR及PCR Southern：细胞总RNA的提取按Trizol一步法RNA提取试剂盒说明进行RNA的提取：5-10×10⁶细胞加入Trizol试剂1mL匀浆后置室温5min，加入氯仿0.2mL，于4℃12000×g离心15min（离心后，混合物分成三部分—底层的酚-氯仿相、中间相和上层的无色水相。RNA在水相，DNA和蛋白质在有机相及中间相），取上清，加异丙醇0.5mL15min后于4℃12000×g离心15min，取沉淀溶于元RNA酶的去离子水中，用于RT-PCR扩增。抽提出的RNA经凝胶电泳鉴定RNA质量，紫外分光光度计260nm和280nm鉴定RNA的纯度。逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）及电泳、结果判定。反应体系为：RNA 2ug 6mer random primer 1ul用无RNAse水加至终体积5ul 90℃10min立即放于冰上。5×缓冲液4μL，（10mM each）dNTP混合物1μL，M-MLV逆转录酶1μL，25mmol MgSO₄5μL，用无RNAse水加至终体积20μL。37℃反转录60min。然后进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，包括10×buffer 5μL，MgCl₂ 1.5 mmol／L，dNTP 0.1 mmol／L，上下游引物各0.5μmmol／L，Taq DNA聚合酶1.0U，cD-NA模板1μL。参数设置如下94℃变性1 min，50℃退火45秒，72℃延伸1min，进行30个周期的循环反应，最后72℃延伸5min。2％琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳100V 30min，紫外灯下观察记录照相。PCR-Southern：用碱变性法将电泳结果转印至Hybond-N+尼龙膜（amersham pharmacia biotec，IRELAND）。用Gene Images 3-oligolabelling Module Kit（Amersham Bioscience RPN5770）标记探针，严格按照说明进行杂交，洗膜，最后用化学发光检测杂交信号。引物序列见附录1。六、质粒的构建与细胞转染合成每条编码shRNA的DNA模板的两条单链，退火DNA单链得到shRNA的DNA双链模板。模板链后面接有RNA PolyⅢ聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计BamHI和HindⅢ酶切位点，可以克隆到siRNA载体多克隆位点的BamHI和HindⅢ酶切位点之间。PSilencer 2.1 hyg（Ambion Inc）空载体用BamHI和HindⅢ双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。把退火的DNA模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶，插入片断与载体的摩尔比约为3：1。连接产物转化DH5α大肠杆菌，在LB Amp培养基上涂板，37℃培养过夜。挑取转化的菌落再进行测序鉴定，确定shRNA编码框架和模板序列正确无误。再将U6启动子和shRNA的DNA双链模板片断连接到Orip-SV-hyg载体上。ShRNA序列见附录1。细胞转染：严格按照Lipofectamine^TM Reagent（Invitrogen 18324）说明进行操作。细胞接种到35mm培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养18～24 h。待细胞贴壁生长达70％融合时，弃去培养液，无血清培养基洗涤细胞1次，滴加含Lipofectamin（20μL）和质粒DNA（2μg）的无血清培养基0.8 mL，轻轻混匀，置37℃、5％CO₂培养箱中培养24 h后更换普通培养液含150 mg／L的hygromycin培养液筛选。48小时后检测。附录1引物及探针序列附录2抗体及所购公司结果一建立的EBV阳性胃癌细胞系AGS／EBV和NUGC3／EBV体外培养呈Ⅰ型潜伏感染：体外感染后筛选的细胞克隆为EBV阳性，EBNA免疫荧光染色见图1。EBV相关蛋白的免疫印记（见图2）显示核蛋白除EBNA1阳性外EBNA2 EBNA3s均为阴性。膜蛋白LMP1也为阴性。RT-PCR检测不被翻译成蛋白的小RNA（EBERs）为阳性（见图3）。而EBV体外转化的LCL则均为阳性，表现Ⅲ型隐形感染。在此作为阳性对照，而EBV阴性细胞作为阴性对照。二5-azacycidine可以活化AGS／EBV和NUGC3／EBV内EBNA Cp（C启动子）并呈计量依存性。RT-PCR法检测AGS／xneo和NUGC3／EBV中EBV EBNA启动子显示Cp Wp均呈不活化状态，Qp为活化状态（见图4）。以相应浓度5-azacycidine处理5天后用RT-PCR及PCR-southern检测启动子，结果显示Cp呈计量依赖性活化（见图5，6）。Wp Qp无明显变化（见图7）。三5-azacycidine处理后伴随着Cp活化，可见LMP1呈计量依赖性表达（见图8）。四5-azacycidine处理后用western blot检测DNA甲基化酶，结果显示DNA甲基化酶1（DNMT1）被明显抑制（见图9）。五用RT-PCR检测EBV潜伏感染Ⅰ型和Ⅲ型Burkitt淋巴瘤细胞系DNA甲基化酶的转录水平，结果显示Ⅰ型细胞中DNA甲基化酶1（DNMT1）和DNA甲基化酶3b（DNM33b）的转录水平明显高于Ⅲ型潜伏感染细胞（见图10）。六用干涉RNA（siRNA）抑制DNA甲基化酶1（DNMT1）不能活化Cp。用Lipofectamin和DNMT1 shRNA的DNA双链模板片断Orip-EBNA1载体转染细胞后可见DNMT1的表达被明显抑制。Western blot检测DNMT1结果见图11。但Cp无明显活化。RT-PCR结果见图12。七干涉RNA（siRNA）抑制DNA甲基化酶1（DNMT1）和抑制DNA甲基化酶3b（DNMT3b）不能明显活化Cp。用干涉RNA（siRNA）抑制DNA甲基化酶1和3b（DNMT3b）不能明显活化Cp。用Lipofectamin和DNMT1 shRNA的DNA双链模板片断Orip-EBNA1载体转染细胞后可见DNMT3b的表达被抑制。而DNMT1表达则增强。相反也可见在DNMT1被抑制时DNMT3b有所增强。Western blot检测DNMT1及3b结果见图13。用RNA干涉法同时抑制DNMT1和3b时Cp有少许活化。RT-PCR及PCR-Southern结果见图14。讨论EBV的潜伏感染主要有3种类型。Ⅲ型潜伏感染主要为体外转化B细胞形成的LCLs（lymphoblastoid cell lines LCLs），体外培养的部分Butkitt淋巴瘤组织由来的细胞系，以及AIDS和脏器移植后的淋巴增殖症和淋巴瘤。该种潜伏感染的细胞表达所有EBV的6种核抗原（EBNA1，2，3A，3B，3C，LP），3种膜蛋白（LMP1，2A，2B），不被翻译成蛋白的小RNA（EBERs），以及BARTs。Ⅰ型和Ⅱ型潜伏感染则表达较少EBV基因。由于EBNA3s是杀伤性T细胞（CTL）的主要靶抗原，所以Ⅰ型和Ⅱ型的感染状态中不易被CTL攻击，病毒感染和宿主免疫形成微妙的平衡状态，使感染成立。在免疫缺陷的情况下可形成Ⅲ型潜伏感染。1990年Burke首次报道了1例与EBV相关的胃癌。1991年Shibata检测出伴有大量淋巴细胞浸润的未分化胃癌中有EBV DNA。次年，他检测了没有大量淋巴细胞浸润的胃腺癌128例，其中22例含EBV DNA。同时在淋巴结、肺或肝的转移灶中也存在EBV DNA。应用ISH法对EBV进行定位，发现阳性检测例的癌细胞核内及核仁中几乎都有EBERs表达。1993年Tokunaga报道了日本人与EBV相关胃癌约占胃癌的6.9％，可发生于胃的各个部位及各种类型的胃癌中。这是最先认为EBV与胃癌相关的报道。以后的研究表明，EBV相关胃癌的发病率约为4-10％左右。EBV的防治重点在于发病前用有效的疫苗防治疾病的发生，以及发病后治疗阶段对病毒阳性细胞进行特异性的杀伤。对于病毒疫苗，在最初阶段，主要集中在病毒的主要壳蛋白gp350的中和抗体的研究来试图研制有效的防治病毒疫苗。然而现在已证实，对单一壳蛋白的中和抗体或抗体和细胞介导相结合都似乎不能长时间防止EBV的经口传染。但无论如何，gp350为基础的疫苗可以减少经口病毒的感染量，如果在合并其他抗原免疫可激活CD8+T细胞的免疫反应可以限制在感染初期病毒的复制。EBV相关肿瘤的特异性治疗目前仍处于理论研究状态。一种方法是利用以EBNA1或LMP1为靶的核酸酶或反义寡核苷酸来抑制EBV阳性肿瘤细胞的生长。另外，基于大多数EBV阳性肿瘤（除免疫缺陷患者外）病毒均呈现严格的潜伏感染状态，而不表达免疫优势的ENBA3A，3B，3C。所以免疫治疗比较困难。除非有方法使解除Cp的甲基化，并使其开始启动转录。已有研究显示可以挽救Cp使其去甲基化。本研究旨在对EBV阳性胃癌的治疗开辟一新的途径。本研究显示，体外通过细胞-细胞感染方式可以成功地建立EBV阳性胃癌细胞系。体外培养呈Ⅰ型潜伏感染。详见结果一。体外培养只表达核抗原中EBNA1，而不表达能成为杀伤性T细胞（CTL）的主要靶抗原EBNA2，EBNA3和LMP1。Cp及Wp均呈失活状态，仅Qp启动转录。有许多研究显示，Cp的失活主要是由于主要调节转录的位点被甲基化。因此在Cp呈不活化状态的Burkitt淋巴瘤，原发性咽喉癌以及胃癌中Cp均被甲基化。EBV相关肿瘤由于肿瘤细胞中均有EBV基因组，因此对这一部分肿瘤的治疗方面，很多研究者均在致力于以EBV为靶。使肿瘤的治疗更为特异性。在Burkitt淋巴瘤细胞中5-azacytidine处理可以使Cp重新活化，在胃癌中尚无报导，本研究首次证实，在EBV阳性胃癌细胞系中，5-azacytidine处理也可以使Cp重新活化，并表达LMP1（见图5，图8）。而且5-azacytidine作用后DNA甲基化酶（DNMT1）的表达被明显抑制（见图9），并呈剂量依赖性。因此推测5-azacytidine可能通过抑制DNA甲基化酶的表达来解除甲基化的。但本研究结果显示用siRNA的方法抑制DNA甲基化酶的表达并不能有效的使Cp活化（见图14，15）。其原因可能是siRNA不能完全抑制DNA甲基化酶的表达（见图13），或抑制一方的同时其他甲基化酶表达增强来代偿。去甲基化试剂用于临床治疗的研究始于1967年。5-azacytidine或其合并其他药物已用于治疗急性白血病和镰状细胞贫血等血红蛋白异常的疾病。在胃癌方面的研究还在体外的阶段，有很多研究表明5-azacytidine可以提高抑癌基因的转录水平。对于EBV阳性胃癌这一特殊类型胃癌的治疗或许有帮助。有待于进一步研究。结论1体外可成功建立的EBV阳性胃癌细胞系，并呈Ⅰ型潜伏感染。2 5-azacytidine可使体外可建立的EBV阳性胃癌细胞系中C启动子活化，表达LMP1。3 5-azacytidine可以抑制DNA甲基化酶1的表达。4用RNA干涉法不能有效活化Cp。