结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,在我国发病率逐年上升。手术、放疗、化疗依然是治疗结肠癌有效的手段。这种传统的治疗方法并不能完全解决结肠癌的复发和转移。如能有效利用人体自身的免疫系统,发挥其对肿瘤组织的特异性杀伤作用,有可能使肿瘤治疗迈上新的台阶。肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)的研究,为解决如何提高肿瘤免疫治疗的疗效开拓了新思路。肿瘤干细胞通过自我更新分化等干细胞行为产生新的肿瘤,这群异质性的细胞是肿瘤发生、复发和转移的根源。因此,有学者提出靶向清除CSCs有可能治愈肿瘤。CSCs理论也为发展新的免疫治疗奠定了基础,使新型免疫治疗的目的不再只是降低肿瘤负荷,而是靶向杀伤肿瘤的“心脏”-CSCs。树突细胞(Dendritic cells, DCs)作为最重要的抗原递呈细胞,是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。以肿瘤干细胞抗原为基础的树突细胞疫苗有望成为靶向杀伤肿瘤干细胞的有效工具。iNKT (invariant natural killer T, iNKT)细胞为一类具有NK细胞和T细胞特性的免疫细胞,其在调节炎症、肿瘤和自身免疫性疾病中发挥着重要作用。通过其表面的TCR受体识别由CDld分子递呈的糖脂类物质(a-galactosylceramide, a-GalCer, α-GC)进而活化,分泌大量细胞因子调节下游DCs、NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞等。本课题利用肿瘤干细胞抗原荷载树突细胞联合糖脂类分子,制备新型肿瘤疫苗,通过协同iNKT和DCs以诱导针对肿瘤干细胞靶向杀伤作用抗肿瘤免疫,为遏制肿瘤转移、复发提供新思路。第一部分ALDH+肿瘤干细胞的分选和鉴定目的：本实验从小鼠结肠癌细胞系MC38,及其在小鼠体内形成的新鲜肿瘤细胞中,采用流式细胞分选技术,以乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)为标志分选出ALDH+细胞；鉴定分选的ALDH+细胞的肿瘤干细胞特性。方法：以C57BL/6小鼠结肠癌细胞系MC38,及其在小鼠体内形成的新鲜肿瘤细胞中,以ALDH为标志,ALDEFLUOR试剂染色,利用流式细胞分选技术,分选出ALDH+细胞。并将分选的细胞体外无血清培养,观察肿瘤细胞球克隆形成能力。体内成瘤实验将不同细胞数目梯度的ALDH+和ALDH-细胞接种小鼠,观察其体内成瘤能力。结果：MC38细胞系中约6%的细胞表达为ALDH+,94%不表达ALDH;新鲜肿瘤细胞中约5%的肿瘤细胞表达ALDH+,95%不表达ALDH。将分选的细胞再次染色,细胞纯度达到98%以上。同样数目的ALDH+和ALDH-细胞在相同条件下,无血清培养基中培养, 结果发现ALDH+细胞有较大、较多的肿瘤细胞球克隆形成；而ALDH-细胞未能或者只形成了极少的细胞集落。同源小鼠体内成瘤实验,结果发现在观察终点内不同梯度的ALDH+细胞均能成瘤,而ALDH细胞均未能成瘤。小结：在小鼠结肠癌细胞系和小鼠结肠癌皮下肿瘤模型中,以ALDH为标记,采用流式分选技术成功分选出具有肿瘤干绌胞特性,纯度高的肿瘤干细胞群ALDH+细胞。因此ALDH可以作为小鼠结肠癌肿瘤干细胞分选的可靠标志。这使我们后续研究体内肿瘤干细胞抗原对机体免疫功能的影响和诱导的靶向CSCs的抗肿瘤免疫成为可能。第二部分肿瘤干细胞疫苗联合糖脂类分子对机体免疫功能的影响目的：以肿瘤干细胞裂解物作为抗原荷载树突状细胞,联合能有效激活iNKT细胞的糖脂类分子a-GC制备新型疫苗。免疫小鼠,验证其在体内对免疫功能的影响。方法：按本实验室建立的方法常规分离与培养同源小鼠骨髓来源的树突细胞。分选的ALDH+,ALDH和未分选的肿瘤细胞反复冻融裂解,细胞裂解物作为抗原荷载树突细胞。将a-GC或不同抗原加入树突细胞培养液常规培养过夜,致敏树突细胞,次日收集树突细胞制备成疫苗。实验小鼠分组：将8周龄,雌性C57BL/6小鼠,按不同疫苗处理因素随机分为6组,每组6只：①PBS处理组(PBS)；②未分选的肿瘤细胞裂解物荷载DC疫苗处理组(tumor);③ALDH细胞裂解物荷载DC疫苗处理组(ALDH-): ④ALDH+细胞裂解物荷载DC疫苗处理组(ALDH+); ⑤α-GC荷载树突疫苗组(α-GC)；⑥ALDH+细胞裂解物联合α-GC荷载DC组(ALDH+α-GC),该组为实验组。按上述所述的分组,将疫苗皮下接种在小鼠的侧腹部。按相同的方法,每周接种一次,每次接种1×106个树突细胞,连续三次。于最后1次免疫后24小时收集小鼠脾脏、肝脏和外周血。检测肝脏中iNKT细胞数量,活化成熟指标CD69,CD40L和胞内分泌IFN-γ量；NK细胞数量,及胞内分泌IFN-γ量；DC成熟活化指标：CD80,CD86和DC胞内及培养液上清IL-12分泌量,同时检测外周血Thl细胞因子(IL-2,TNF-α,IFN-γ)和IL-12;Th2型细胞因子(1L-4,IL-5)等表达量。同样的方法独立重复三次实验。结果：1.实验组疫苗能增加肝脏中iNKT细胞的数量：实验组与ALDH+目比差异有统计学意义(P=0.0400)；与未分选肿瘤组差异有统计学意义(P=0.0200)；与PBS组和ALDH-组差异均有统计学意义(P<0.05)；与a-GC组没有明显差异。ALDH+组和未分选肿瘤组差异有统计学意义(P=0.0200)。这些结果说明,肿瘤干细胞疫苗比传统完整肿瘤细胞疫苗能更好的刺激机体增加iNKT细胞的数量,联合α-GC制成的新型疫苗大大增强了这一效果。2.实验组疫苗能上调iNKT细胞CD69的表达：实验组与ALDH+组差异有统计学意义(P=0.0300)；与未分选肿瘤组差异有统计学意义(P=0.0050)；与a-GC组差异有统计学意义(P=0.0100)；与PBS组和ALDH组差异均有统计学意义(P<0.0100)。ALDH+组与未分选肿瘤(tumor)组差异无统计学意义(P=0.1500)。这些结果表明肿瘤干细胞疫苗虽然比传统完整肿瘤上调了iNKT细胞表面CD69表达但无统计学意义,而联合a-GC后差异明显,说明肿瘤干细胞联合α-GC这种新型疫苗在体内能更好促进iNKT细胞的活化成熟。3.实验组疫苗能上调iNKT细胞CD40L表达水平：实验组与ALDH+组差异有统计学意义(P=0.0080)；与未分选肿瘤组差异有统计学意义(P=0.0078)；与α-GC组差异有统计学意义(P=0.0028)；实验组与PBS组和ALDH差异均有统计学意义(P<0.01)。ALDH+组与未分选肿瘤组差异有统计学意义(p=0.0161)。结果表明：肿瘤干细胞疫苗能显著上调iNKT细胞CD40L表达,联合a-GC加强了这一作用。 4.实验组疫苗能促进iNKT细胞胞内分泌IFN-γ:实验组与ALDH+组差异有统计学意义(P<0.0001)；与a-GC组差异无统计学意义(P=0.06)； 实验组与未分选肿瘤组差异有统计学意义(P=0.0026)；实验组与ALDH组和PBS组差异均有统计学意义(P<0.0001)。ALDH+组与未分选肿瘤组差异有统计学意义(p=0.0171)。结果说明：肿瘤干细胞疫苗比传统的完整肿瘤细胞疫苗能大大促进iNKT细胞分泌IFN-γ,联合a-GC增强了这一功能。5.实验组疫苗能促进NK细胞胞内IFN-γ的分泌：实验组与ALDH+组差异有统计学意义(P=0.0300)；实验组与其未分选肿瘤组差异有统计学意义(P=0.0220)；实验组与α-GC组差异有统计学意义(P=0.0400)；实验组与ALDH组和PBS组差异有统计学意义(P<0.05)。ALDH+组与未分选肿瘤组相比差异无统计学意义(P=0.0926)。结果表明：肿瘤干细胞疫苗虽然在不同程度上增加了NK细胞分泌IFN-γ的能力,但无统计学意义,而肿瘤干细胞疫苗联合a-GC明显增加了这一功能。6.实验组疫苗能上调DCs表面CD80的表达：实验组与ALDH+组差异无统计学意义(P=0.5451)；与ALDH+组差异有统计学意义(P=0.0053)；与α-GC组差异有统计学意义(P=0.0300)；与ALDH组和PBS组差异有统计学意义(P<0.01)。ALDH+组与未分选肿瘤组差异有统计学意义(P=0.0130)。结果表明,肿瘤干细胞疫苗与传统完整肿瘤细胞疫苗相比能上调DCs表面CD80的表达,而这一作用联合a-GC得到了加强。 7.实验组疫苗能上调DCs表面CD86的表达：实验组与ALDH+组相比差异无统计学意义(P=0.0653)；与未分选组相比差异有统计学意义(P=0.0096)；与a-GC组差异有统计学意义(P=0.0010)；与ALDH组和PBS组相比差异有统计学意义(P<0.01)。ALDH+组与未分选肿瘤组相比差异有统计学意义(P=0.0037)。结果表明：肿瘤干细胞疫苗能上调DCs表面CD86的表达,联合a-GC加强了这一作用。 8.实验组疫苗能增加DCs胞内IL-12的分泌量：实验组与ALDH+组相比差异有统计学意义(P=0.0250)；与未分选肿瘤组相比差异有统计学意义(P=0.0069)；与a-GC组相比差异有统计学意义(P=0.0350)；与ALDH组和PBS组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。ALDH+组与未分选肿瘤组相比差异无统计学意义(P=1.0000)。结果表明：肿瘤干细胞疫苗与传统完整肿瘤细胞疫苗并没有增加DCs胞内表达IL-12,而联合α-GC后明显增加了DCs胞内IL-12的分泌。 9.实验组疫苗能增加树突细胞培养液IL-12的分泌：实验组与ALDH+组相比差异无统计学意义(P=0.0745)；实验组与未分选组相比差异有统计学意义(P=0.0198)：实验组与α-GC组相比差异有统计学意义(P=0.0171)；实验组与ALDH组和PBS组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。ALDH+组与未分选肿瘤组相比差异有统计学意义(P=0.0342)。结果表明肿瘤干细胞疫苗与传统完整肿瘤细胞疫苗相比增加了DCs上清IL-12的分泌,而联合α-GC增强了这一作用。10.实验组疫苗能增加血清IL-12,IFN-γ,,TNF-α,IL-2的分泌(P<0.05),一定程度上抑制了Th2型细胞因子IL-4,IL-5的分泌。小结：成功制备了肿瘤干细胞联合α-GC荷载树突细胞的新型疫苗,能促进iNKT细胞的成熟和活化,上调了CD69,CD40L的表达,促进iNKT细胞IFN-γ的分泌；促进NK细胞IFN-γ的分泌；能促进DCs的成熟与活化,上调DCs表面CD80,CD86的表达；促进DCs分泌IL-12；促进体内Th1型细胞因子分泌,抑制Th2型细胞因子产生；朝着向Th1转化,有利于发挥抗肿瘤作用。第三部分 肿瘤干细胞疫苗联合糖脂类分子增强抗小鼠结肠癌免疫目的：肿瘤干细胞抗原荷载树突细胞联合α-GC这种新型疫苗免疫小鼠,能促进体内iNKT细胞,NK细胞和DCs等免疫细胞的活化成熟。在小鼠结肠癌模型中,我们进一步验证这种新型疫苗对小鼠结肠癌的抗肿瘤作用,并探讨其潜在的机制。方法：肿瘤干细胞抗原的获得和疫苗的制备方法同第一部分。将8周龄,雌性C57BL/6小鼠,按不同疫苗处理因素随机分为6组,每组8只：①PBS处理组(PBS)；②未分选的肿瘤细胞裂解物荷载DC疫苗处理组(tumor)；③ALDH细胞裂解物荷载DC疫苗处理组(ALDH-)；④ALDH+细胞裂解物荷载DC疫苗处理组(ALDH+)；⑤α-GC荷载树突疫苗组(α-GC)；⑥ALDH+细胞裂解物荷载DC疫苗联合α-GC处理组(ALDH+αGC),本组为实验组。按上述所述的分组,将疫苗皮下接种在小鼠的侧腹部。按相同的方法,每周接种一次,每次接种1×106个树突细胞,连续三次。同样的方法重复三次独立实验。治疗性疫苗的应用：建立小鼠皮下结肠癌模型,在皮下接种肿瘤细胞后分别于第3天,10天和17天皮下注射疫苗。观察小鼠皮下肿瘤生长情况,并观察荷瘤小鼠的生存期。预防性疫苗的应用：小鼠皮下每周1次注射疫苗共3次,在最后1次注射疫苗的同时皮下接种肿瘤细胞。观察肿瘤的生长情况。观察终点时收集小鼠外周血和脾脏,检测小鼠外周血中的CD3+T,CD4+T,CD8+T细胞比率；同时检测小鼠脾脏中髓性抑制细胞(Myeloid drived suppressor cell,MDSC)的比率。以分选ALDH+细胞为靶细胞,以免疫小鼠脾脏细胞为效应细胞进行细胞杀伤实验,了解这种新型疫苗针对肿瘤干细胞靶向杀伤的作用。结果：在治疗性疫苗中,实验组疫苗能： 1.延迟小鼠皮下成瘤时间,实验组小鼠平均成瘤时间为(18.4±3.1)天,与其它组相比差异有统计学意义(P<0.01)。2.能延缓肿瘤的生长,观察终点时实验组小鼠肿瘤平均大小为(58.66±12.71)mm2,与其它组相比差异有统计学意义(P<0.05)。3.能延长荷瘤小鼠的生存期,实验组小鼠平均存活时间为(105±7.42)天,ALDH+组平均生存天数为(94±7.19)天,比ALDH+组有所延长,差异无统计学意义(P=0.2588),与其它组相比差异有统计学意义(P<0.01)；ALDH+组与未分选肿瘤组相比差异有统计学意义(P=0.0333),以上结果说明肿瘤干细胞疫苗与传统完整肿瘤细胞疫苗相比能明显延长荷瘤小鼠的生存期,联合a-GC使这一作用更加明显。在预防性疫苗中,实验组疫苗能：1.明显抑制小鼠皮下成瘤时间,实验组小鼠平均成瘤时间为(28.31±1.5)天,与其它组相比,差异有统计学意义(P<0.01),且有部分小鼠没有成瘤。2.抑制肿瘤生长,实验终点时测量肿瘤大小,实验组肿瘤平均大小为(41.67±11.61)mm2,ALDH+组肿瘤平均大小为(100.33±11.26)mm2,实验组肿瘤小于ALDH+组,差异无统计学意义(P=0.0520),但与其它组相比,差异有统计学意义(P<0.05), ALDH+组与未分选肿瘤组相比差异无统计学意义(P=0.0813)。以上结果说明肿瘤干细胞疫苗与传统完整肿瘤细胞疫苗相比在预防性疫苗的中并没有明显抑制肿瘤的生长,而联合α-GC能明显抑制小鼠肿瘤的生长。3.减少MDSC的比率,观察终点小鼠脾脏中MDSC比率,在实验组平均为(2.18±±0.60)%, ALDH+组为(4.39±0.93)%,实验组平均MDSC比率小于ALDH+,尚未达到统计学意义(P>0.05), 但与其它组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。ALDH+组与未分选肿瘤组差异无统计学意义(P=0.2091)。以上结果说明肿瘤干细胞疫苗与传统完整肿瘤细胞疫苗并无显著抑制了MDSC的比率,而肿瘤干细胞疫苗联合α-GC明显抑制了小鼠脾脏中MDSC的比率。4.增加CD8+T细胞比率,小鼠外周血CD8+T细胞比率检测,实验组平均为(52.7±2.37)%,ALDH+组平均为(43.73±±2.22)%,二者差异无统计学意义(P>0.05),但与其它组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。ALDH+组与未分选肿瘤组差异有统计学意义(P=0.0343)。以上结果说明,肿瘤干细胞疫苗比完整肿瘤细胞相比能增加CD8+T细胞的比率,联合a-GC能增加这种作用,从而增加细胞毒细胞的靶向杀伤肿瘤干细胞的作用。5.诱导靶向杀伤肿瘤干细胞反应,肿瘤干细胞杀伤实验中,当效应细胞与靶细胞比例(E：T)分别为5：1、10：1、20：1、40：1时,随着效：靶比(E：T)的增加,各组产生的CTLs对ALDH+细胞的杀伤率均随之增强,但实验组杀伤率增加最为明显,与其它各组差异有统计学意义(P<0.0I)。当(E：T)为40：1时实验组发挥了最大的杀伤效应,平均杀伤率为(73.6±3.00)%。杀伤率统计结果为：实验组与ALDH+组差异有统计学意义(P=0.0088),实验组杀伤率明显高于其余各组,差异均有统计学意义(P<0.01)；ALDH+组与未分选肿瘤组差异无统计学意义(P=0.0550)。在(E：T)比为20：1时杀伤率差异统计结果：实验组与ALDH+组差异有统计学意义(P=0.0156)；与其余各组差异有统计学意义(P<0.05),ALDH+组与未分选肿瘤组差异有统计学意义(P=-0.0203)。当(E：T)为10：1时杀伤率统计结果：实验组与ALDH+组差异无统计学意义(P=0.2048)；与其余各组组差异有统计学意义(P<0.0001),ALDH+组与未分选肿瘤杀伤率相似。当(E：T)为5：1时杀伤率统计结果：实验组与ALDH+组差异无统计学意义(P=0.2952)；与其余各组差异有统计学意义(P<0.0001),ALDH+组与未分选肿瘤杀伤率相似。以上结果表明,在效应细胞和靶向杀伤细胞达到一定比值时发挥了很好的靶向杀伤效果,当效应细胞和靶细胞比值在20：1和40：1的时候肿瘤干细胞疫苗联合a-GC与传统完整肿瘤细胞疫苗相比杀伤靶细胞的作用明显增强。这些结果说明,肿瘤干细胞疫苗联合α-GC,在体内能诱导出针对肿瘤干细胞靶向杀伤作用的CTL细胞,在抗肿瘤免疫中发挥了靶向肿瘤干细胞的细胞毒作用。小结：肿瘤干细胞疫苗联合糖脂类分子明显的延长了荷瘤小鼠的生存期,抑制了肿瘤的生长。增加了CD8+T细胞的比率,减少了MDSC的比率,诱导出了特异性靶向杀伤肿瘤干细胞的免疫反应。全文结论：1.以ALDH肿瘤干细胞标志在小鼠结肠癌模型中,成功分选和鉴定了ALDH+细胞肿瘤干细胞特性。2.肿瘤干细胞疫苗联合糖脂分子能促进iNKT、NK细胞活化和诱导DC成熟,并促进Thl型细胞因子分泌。3.肿瘤干细胞疫苗联合糖脂分子能诱导出特异性靶向杀伤肿瘤干细胞的细胞毒作用,减少MDSC比率,抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠生存期。