研究背景多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种恶性浆细胞病,主要特征为骨髓内克隆性浆细胞异常增生,分泌大量单克隆免疫球蛋白或轻链(M蛋白),极少数患者也可以不产生M蛋白。克隆性浆细胞及其分泌的M蛋白直接浸润机体组织器官,导致临床上的各种症状,最常见的有骨痛或多发性溶骨性损害、贫血、肾脏损害及感染。其中,感染是MM患者最常见的首发症状之一,也是治疗过程中非常严重的并发症之一,更是导致MM患者死亡的重要原因之一。研究表明：约10%的MM患者在初诊的60天内死亡,其中约50%的患者死于感染。MM患者易发生感染主要是因为骨髓内单克隆浆细胞异常增殖,过度分泌单克隆免疫球蛋白或κ/λ轻链,使正常免疫球蛋白的合成及分泌受抑,导致患者的体液免疫功能缺陷,对病原微生物的抵御能力下降。此外,T/B细胞数量和功能的异常、中性粒细胞生成的减少、化疗药物对正常浆细胞的破坏以及肾上腺皮质激素的应用,也导致MM患者机体的免疫功能进一步减低,增加了感染发生的风险。甘露聚糖结合凝集素(mannose-binding lectin, MBL)作为天然免疫系统补体系统中的一员,由数个相同的多肽链组成,每条多肽链由4个部分组成：富含半胱氨酸的N末端区(N-terminal segment, N-TS)、胶原样区(Collagen-like region, CLR)、α-螺旋区(颈区)(Helical coiled hinge region, HCHR)、C末端Ca2+依赖的碳水化合物结合区(Carbohydrate recognition domain, CRD)。其中CRD区能选择性识别多种病原微生物表面的糖结构,包括N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰甘露糖胺、D-甘露糖、L-岩藻糖等。相同的3条多肽链组成一个亚基,两个以上的亚基聚合形成MBL寡聚物(如二聚体、六聚体等),但一般只有四聚体以上的寡聚物才可以发挥作用。MBL主要由肝细胞合成,其血浆水平的高低主要由MBL2基因决定。目前研究发现MBL2基因启动子区-619(H/L)、-290(X/Y)、-66(P/Q)及外显子1区第52(A/D)、54(A/B)、57密码子(A/C)基因位点的变异对血浆MBL水平的影响较大,其中启动子区基因位点的变异可能在转录水平调控MBL的合成,而外显子1区的单碱基变异则导致MBL多肽链上胶原样区的正常氨基酸被替代(如精氨酸(Arginine, Arg)被半胱氨酸(Cysteine, Cys)替代、甘氨酸(Glycine,Gly)被天冬氨酸(Aspartic acid, Asp)替代、甘氨酸被谷氨酸(Glutamic acid,Glu)替代),致使多肽链结构遭到破坏,肽链不能形成稳定的多聚体而被降解,最终导致血浆MBL水平低下。MBL能识别、结合多种病原微生物表面的糖配体,并通过激活补体系统、调理吞噬及调节炎症反应等帮助机体杀灭病原体,其血浆水平的高低对机体抵御病原微生物的入侵有较重要的意义。目前,国外多个学者研究发现：MBL血浆水平高的或携带高表达MBL基因型的肿瘤患者化疗期间感染的发生率低,表明MBL可能可以帮助肿瘤患者抵御化疗期间感染的发生,但也有学者认为MBL基因位点的多态性及血浆水平的高低与肿瘤患者化疗期间感染的发生无明显关系,结论目前尚不统一。近年来,关于MBL与MM患者化疗期间感染的关系研究较少,国外仅有一个中心进行相关研究,结果显示：AA型和AO/OO型(B、C、D等位基因统称为O基因)MM患者之间自体造血干细胞移植及诱导化疗期间普通感染的发生率无差异,但AA型MM患者重度感染的发生率低于AO/OO型患者,表明AA基因型可能可以帮助MM患者抵御自体造血干细胞移植及诱导化疗期间重度感染的发生。但目前国内外尚无其他相关研究进一步证实。目的和意义本研究通过分析MBL2基因位点多态性及其血浆表达水平与MM患者第1-2疗程诱导化疗期间感染的关系,探讨MBL2基因位点变异及血浆水平低下是否为MM患者诱导化疗期间发生感染的相关因素。方法1病例选择根据2011年《中国多发性骨髓瘤诊治指南》的诊断标准,将2012年1月1日至2013年9月30日在我院治疗的初治MM患者纳入实验,共60例患者入组。2实验方法化疗开始前收集入组的60例MM患者的外周血DNA及血浆标本,应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)测序法检测MBL2基因位点的多态性；应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测血浆MBL水平。3研究内容首先,比较MM患者与正常人MBL2基因不同位点基因型频率及基因频率的差异；其次,分析MBL2基因位点多态性与血浆MBL水平的关系；然后,分别分析MBL2基因位点多态性与MM患者第1-2疗程诱导化疗期间感染的关系；最后,分析血浆MBL水平与初治MM患者感染的关系。4统计学分析本实验采用SPSS17.0软件进行统计学分析。首先,应用Fisher确切概率法、Mann-Whitney U检验法、t检验法比较不同基因型及血浆水平的患者临床资料的差异；其次,应用Mann-Whitney U检验法及Kruskal-Wallis H检验法比较不同基因型及血浆水平的MM患者第1-2疗程诱导化疗期间感染发生次数、发热持续时间的差异。所有P值均为双向,并定义P<0.05为差异有统计学意义。结果1MM患者MBL2基因位点多态性47例患者检测的MBL2基因6个位点的多态性中,A/D、A/C位点未检出变异,H/L、X/Y、P/Q及A/B4个位点检出变异。检出变异的4个位点的基因频率及基因型频率符合哈迪温伯格平衡,6个位点的基因频率及基因型频率与其在PubMed的SNP位点数据库中中国汉族人群的基因频率及基因型频率相似。因H/L、X/Y、P/Q及A/B基因位点连锁不平衡,本研究共发现5种单体型(HYPA、LYPA、LYPA、LYPB)和13种基因型(HYPA/HYPA、 LYPA/HYPA、LYQA/HYPA、LXPA/HYPA、LYQA/LYQA、LYPA/LXPA、 LYQA/LXPA、LXPA/LXPA、LYPB/HYPA、LYPA/LYPB、LYQA/LYPB、 LYPB/LXPA、LYPB/LYPB)。2MBL2基因位点多态性与血浆MBL水平的关系44例患者同时检测了MBL2基因位点多态性和血浆MBL水平。依次分析外显子1区A/B位点及启动子区H/L、Y/X、P/Q位点基因多态性与血浆MBL水平的关系,结果显示：A/B及H/L基因位点多态性对血浆MBL水平有影响(P=0.000,P=0.000),其中A/A型患者的中位血浆MBL水平>A/B型>B/B型(2396.68ng/ml vs536.06ng/ml vs73.22ng/ml), H/H型患者的中位血浆MBL水平>H./L型>L/L型(2669.62ng/ml vs1829.89ng/ml vs509.35ng/ml);未发现X/Y、P/Q基因位点多态性与血浆MBL水平相关(P>0.05)。因A/B及H/L基因位点多态性对血浆MBL水平均有影响,故分析所有患者基因型与血浆MBL水平的关系,结果发现：携带A/A型的患者中位血浆MBL水平>A/B型>B/B型,表明A/B位点对血浆MBL的水平影响最大。因此将患者分为AA型和AB/BB型,进一步分析其他位点对AA型或AB/BB型患者血浆MBL水平的影响,结果显示：H/L基因位点多态性对AA、AB/BB型患者血浆MBL水平皆有影响(P=0.002,P=0.003)；而Y/X位点仅对AA型患者血浆MBL水平有影响(P=0.000),对AB/BB型患者无影响(P=0.144)；P/Q基因位点多态性对AA型及AB/BB型患者血浆MBL水平均无影响(P>0.05)。综上,因H/L位点多态性对AA型和AB/BB型患者血浆MBL水平皆有影响,故将患者分为HA/HA、LA/HA、LA/LA、LB/HA、LA/LB、LB/LB6种基因型,分析不同基因型患者之间血浆MBL水平的关系,结果显示不同基因型患者之间血浆MBL水平有差异,且差异有统计学意义(P=0.000)。其中HA/HA型患者中位血浆MBL水平>LA/HA型>LA/LA型>LB/HA型>LA/LB型>LB/LB型(2783.15ng/ml vs2396.68ng/ml vs1536.06ng/ml vs662.77ng/ml vs228.87ng/ml vs73.22ng/ml)。3MM患者第1-2疗程诱导化疗期间感染与MBL2基因位点多态性的关系AA型患者中发生临床感染、肺炎及感染的比例低于AB/BB型患者(12.12%vs28.58,36.36%vs42.86%,48.48%vs71.43%),但两种基因型患者不明原因发热、临床感染、肺炎及感染的累积发生频率无差异(P>0.05)。对于发热的患者来说,AA型中发热患者第1-2疗程的中位累积发热持续时间低于AB/BB型患者,且有统计学意义(2天vs8天,P=0.001)。此外,因A/B位点及H/L位点对血浆MBL水平影响较大,我们分析了HA/HA、LA/HA、LA/LA、LB/HA、LA/LB、LB/LB6种不同基因型患者不明原因发热、临床感染、肺炎及感染的累积发生频率,结果显示无统计学意义(P>0.05),且对于发热患者的累积发热持续时间也无统计学意义(P>0.05)。4MM患者第1-2疗程诱导化疗期间感染与血浆MBL水平的关系1-2疗程未发生感染的患者中位血浆MBL水平高于发生感染患者的(2362.44ng/ml vs1576.13ng/ml, P=0.019);且对于多次(≥2次)发生感染的患者,中位血浆MBL水平明显低于仅发生1次或未发生感染的患者(163.45ng/ml vs1796.48ng/ml vs2362.44ng/ml, P=0.008).此外,我们以1000ng/ml为界点,根据患者初诊时血浆MBL水平,将患者分为低于1000ng/ml和高于1000ng/ml组,分析发现血浆MBL水平低于1000ng/ml的患者不明原因发热及临床感染的累积发生次数无差异(P>0.05),但肺炎及感染的发生频率高于血浆MBL水平大于1000ng/ml的患者(0次vs1次,P=0.014；0次vs1次,P=0.001),且发热患者累积发热的持续时间也长于后者(7.5天vs2天,P=0.006)。结论1MM患者与中国汉族人群中MBL2基因启动子区及外显子1区6个SNP位点的基因频率及基因型频率无差异。2外显子1区及启动子区6个基因位点多态性对血浆MBL水平影响力依次为：A/B位点>H/L位点>X/Y位点,未发现P/Q位点多态性对血浆MBL水平有影响。3A/B位点的多态性与MM患者诱导化疗期间感染的发生有相关性,其中AA型基因型MM患者诱导化疗期间发热的累积持续时间较AB/BB型患者短,且感染的累积发生率有降低的趋势。4高血浆MBL水平的MM患者第1-2疗程诱导化疗期间感染的发生率低于低血浆MBL水平的MM患者,且发热患者的累积发热持续时间也短于后者。