背景:缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)是一种常见的危害人类健康的疾病,仅2012年一年死亡人数就达740万。并且,IHD耗费医疗资源惊人,通过溶栓、PCI等治疗手段尽快恢复冠状动脉血流供应是挽救患者生命的关键,但研究发现心肌缺血持续一段时间后,重新恢复血流灌注会给心脏组织带来新的损伤,出现心肌顿抑、心功能降低及恶性心律失常发作等继发性心肌损害——缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)。研究心脏缺血再灌注损伤的发生机制,探讨有效的IRI心肌保护措施长期以来都是心血管病医生孜孜以求的梦想。目前认为,心脏缺血再灌注损伤与心肌线粒体能量代谢障碍、细胞内钙超载、氧自由基释放和细胞凋亡等有关。细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)家族是特征性SOCS盒胞浆蛋白分子家族,包括SH2核心结构及具有保守性的C端40个氨基酸模块。该家族存在多种细胞内并可被诱导表达。目前发现该家族有CIS(the cytokine-inducible SH2 domain-containing protein)、SOCS1-7等8个成员分子。SOCS通过竞争结合JAK催化位点从而抑制JAK信号通路。其中SOCS1与SOCS3同源性最强,与心血管疾病关系最为密切。既往研究发现SOCS1竞争心肌营养素-1(cardiotrophin-1,CT-1)下游信号通路JAK的催化位点,从而抑制JAK-STAT3信号转导通路,导致心肌细胞凋亡增加及心肌梗死面积扩大。Micro RNA(miRNA)是一类内生的、长度约为18~25个核苷酸的小RNA,通过对靶m RNA降解或者翻译抑制在转录后水平发挥对靶基因负调控作用。参与细胞内多种重要调节。研究发现miRNA参与了心脏发育、心肌肥厚及重塑、心律失常、心力衰竭及心肌细胞凋亡等病理生理过程。在心肌成纤维细胞中,miR-19a通过调控TGF-βR II抑制自噬。又有报道miR-19与心肌细胞凋亡有关;最近研究发现miR-19b在心脏缺血再灌注损伤中通过调控PTEN抑制心肌细胞凋亡。鉴于miR-19a与miR-19b同源于miR-17-92基因簇,miR-19a极有可能参与心脏缺血再灌注损伤。最近又有研究发现,在肝细胞中miR-19a靶向抑制SOCS3表达增加JAK-STAT的转录并促进肝细胞增殖。由此我们推测,在缺血再灌注损伤过程中,miR-19a可能通过靶向调控SOCS3抑制心肌细胞凋亡。综上所述,我们推测在心肌IRI过程中可能存在的一个调控过程:心肌IRI时保护性细胞因子(比如CT-1等)表达上调,诱导JAK-STAT3活性增强,导致STAT3磷酸化活性增强可以上调SOCS3表达,SOCS3反过来竞争结合JAK并抑制其表达,抵消一部分STAT3对心肌细胞抗凋亡作用。如果miR-19a能抑制SOCS3的表达,间接提高JAK-STAT3的活性并增强在IRI中的抗凋亡作用。为了证实这一推测。本研究进行一下三方面的探索:首先,通过离体实验探讨SOCS3在缺血再灌注损伤中的促凋亡作用,将建立心肌细胞缺氧复氧模型,通过细胞存活率检查、生化检测等体外实验证实SOCS3与促凋亡蛋白Bim之间的关系。其次,在离体实验探讨miR-19a对SOCS3靶向调控作用机制。通过miR-19a过表达及抑制实验检测SOCS3的蛋白表达以及对心肌细胞凋亡的影响。第三,为探讨SOCS-3与急性心肌梗死具有相关性,以急性心肌梗死患者作为研究对象,分析高表达SOCS3是否可以预测心脏主要不良事件。第一部分探讨在心肌细胞缺氧复氧过程中SOCS3与Bim之间的关系及对细胞凋亡的影响目的:建立H9c2心肌细胞缺氧复氧模型,明确SOCS3在心肌细胞缺氧复氧中对Bim表达影响及细胞凋亡的影响。方法:1)培养H9c2心肌细胞。2)模拟缺血再灌注损伤建立缺氧复氧(Hypoxia reoxygenation,HR)模型,Western-blot检测SOCS3表达。3)设计与合成3对靶向SOCS3基因的si RNA(SOCS3-si RNA),Western-blot筛选最佳SOCS3-si RNA。4)将效果最佳SOCS3-si RNA转染H9c2,给予缺氧复氧。实验分4组:空白对照组(Control组)、HR组、HR+Negative Control组、HR+SOCS3-si RNA组;5)用CCK8法检测细胞增殖活力,Flow cytometry检测细胞凋亡率,Western-blot技术分别测定SOCS3、凋亡相关基因Bim、Bax和Bcl-2凋亡蛋白的表达。结果:1)缺氧复氧模过程中SOCS3表达明显上调。2)与空白对照组相比,HR组细胞存活率明显减少(P<0.05),SOCS3-si RNA组H9c2存活率明显增加(P<0.05),凋亡率明显下降(P<0.05);3)与HR组相比,SOCS3-si RNA+HR组Bim表达下调(P<0.01);4)与HR组相比,SOCS3-si RNA+HR组,Bcl-2表达上调,Bax表达下调,Bcl-2/Bax比值增大(P<0.05)。结论:1)H9c2心肌细胞在缺氧复氧后,SOCS3表达明显升高;2)在心肌细胞缺氧复氧模型中,沉默SOCS3可以下调Bim和Bax的表达;3)在心肌细胞在缺氧复氧模型中,沉默SOCS3可以上调Bcl-2的表达4)在心肌细胞在缺氧复氧模型中,沉默SOCS3可以升高细胞活力,减少细胞凋亡。第二部分:缺氧复氧心肌细胞中SOCS3对JAK-STAT3信号通路的影响及miR-19a对其调控作用目的:本研究拟建立H9c2心肌细胞HR模型,测定miR-19a在HR过程中表达,在H9c2中转染miR-19a mimics或miR-19a inhibitor调控miR-19a的表达,测定细胞SOCS3的表达及细胞凋亡率、凋亡相关基因蛋白表达水平,探讨miR-19a在心肌细胞缺氧复氧中对SOCS3调控作用及介导HR细胞凋亡的影响。方法:1)模拟缺血再灌注损伤建立HR模型,q RT-PCR检测miR-19a表达。2)使用Lipofectamine3000分别将miR-19a mimics及miR-19a inhibitor转染入H9c2细胞,给予缺氧复氧。3)实验分6组:空白对照组(Control组)、HR、HR+mimics Negative Control、HR+miR-19a mimics组、HR+Mirco RNA inhibitor Negative Control组、HR+miR-19a inhibitor组;4)CCK8检测细胞活力,Flow cytometry检测细胞凋亡率,Western-blot技术分别测定SOCS3、p-STAT3、STAT3、Caspases、Bim、Bax和Bcl-2的表达。结果:1)HR过程中miR-19a表达明显下调。2)HR组较control组细胞存活率明显减少(P<0.05),miR-19a mimics组H9c2细胞存活率明显增加(P<0.05),凋亡率明显下降(P<0.05);miR-19a inhibitor组H9c2细胞存活率明显下降(P<0.05),凋亡率明显增加(P<0.05);3)过表达miR-19a明显抑制SOCS3、Caspases、Bim及Bax蛋白表达,上调p-STAT3活性及Bcl-2蛋白,抑制细胞凋亡。4)抑制miR-19a明显上调SOCS3、Caspases、Bim及Bax蛋白表达,抑制 p-STAT3活性,Bcl-2表达下调,促进凋亡。结论:1)H9c2心肌细胞缺氧复氧后,miR-19a表达明显下调;2)心肌细胞缺氧复氧过程中,miR-19a可能通过调控SOCS3发挥抗凋亡作用;第三部分血浆SOCS-3上调与急性心肌梗死不良预后相关性分析目的:人血浆SOCS-3上调与急性心肌梗死不良预后相关性分析方法:入选2016.3-2016.10在我院就诊急性心肌梗死(AMI)患者(n=68),同期选择年龄、性别等相匹配的,无心血管系统疾病的自愿者作为健康对照组(n=20)。采用酶联免疫(ELISA)测定SOCS3、c Tn I和CK-MB。并将SOCS3与c Tn I、CK-MB、NT-pro BNP、e GFR、左室射血分数(left ventricular ejection fraction LVEF)、冠状动脉病变血管数、Killip心功能分级和主要不良心血管事件(MACE)等行相关分析。结果:AMI患者血浆SOCS-3表达水平显著高于健康对照组(P<0.01);通过ROC曲线比较,血浆SOCS-3区分AMI患者的敏感性和特异性分别为70.0和85.5(AUC=0.856)。SOCS-3水平与高血压(P=0.002),左心室射血分数(LVEF)(P=0.004),e GFR(P<0.001),c Tn I(P<0.001),CK-MB(P<0.001),NT-pro BNP(P<0.001)等临床病理参数显著相关。此外,AMI患者冠状动脉狭窄数目越多,血浆SOCS-3水平越高。SOCS-3水平与Killip心功能分级相关,Killip心功能分级越高的患者血浆SOCS-3水平越高。AMI患者中,根据两分位中位数,高血浆SOCS-3比低血浆SOCS-3患者具有更高主要不良心血管事件(MACE)发生率(P<0.01)。同样,高血浆SOCS-3较低血浆SOCS-3患者,6个月总体存活率更低(P<0.01)。血浆SOCS3是MACE的独立危险因素。结论:SOCS-3是预测急性心肌梗死预后有价值的生物学标指标。总之,从分子、细胞和在体多层面证实通过抑制SOCS3的表达减轻缺血再灌注心肌损伤,为深入理解SOCS3的调控机制进而对心肌保护机制做有益的探索。