研究背景:胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤,由于早期缺乏特异的临床症状和有效的筛查手段,大部分患者在就诊时已处于进展期,严重影响其预后。因此,胃癌的早期诊断十分重要。目前胃镜联合组织病理学检查是诊断胃癌的金标准,但庞大的人口基数、操作引起的不适以及对检查者水平的依赖等使其不适用于大规模筛查。另外,血清肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA72-4虽然常用于胃癌的辅助诊断,但其敏感性及特异性均欠佳。因此,需要一种新型、有效的生物学标志物。近年来,外泌体逐渐成为研究的热点之一。外泌体是一种直径约30-150nm的微小膜泡,具有脂质双层膜结构,可以被机体的大多数细胞所分泌,在细胞微环境中广泛存在,参与多种疾病的发生与进展。有研究发现外泌体在胃癌的进展中起着重要的作用,认为外泌体含量可能是理想的生物学标志物。随着生物学检测水平的不断提高,mRNA作为各种疾病的标志物已被广泛研究。因此,外泌体中的mRNA也受到众多研究者的关注。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一个锌依赖性内肽酶家族,是引起细胞外基质降解的主要酶类之一,根据酶是在细胞表面以膜形式存在还是被分泌,可将其分为膜型和分泌型两个类型。膜型1-基质金属蛋白酶(membrane type 1-matrix metalloproteinase,MT1-MMP),又称为 MMP14,是膜型基质金属蛋白酶(MT-MMPs)家族中第一个被发现的蛋白水解酶,有研究发现其在肿瘤的进展中起着重要的作用。近年来,已有许多研究发现MT1-MMP在胃癌中起着重要作用,有研究表明MT1-MMP表达的增加与胃癌预后不良相关。但是,目前关于MT1-MMP的研究主要集中在组织样本上,关于外周血MT1-MMP的报道较为少见。蛋白质和mRNA在血清中的稳定性很容易受到储存时间和温度变化的影响,但有研究发现外泌体在血清中稳定存在,因此我们尝试去发现一种基于外泌体的稳定的生物学标志物。由于MT1-MMP在胃癌中的重要性已被许多研究证实,并且之前有研究报道其存在于外泌体中,因此我们认为血清外泌体MT1-MMP mRNA可能是胃癌的一种潜在的生物学标志物。目前关于胃癌患者外泌体MT1-MMP mRNA的研究主要集中在组织样本上,血清学研究相对较少,其在胃癌中的潜在意义也尚不明确。本研究分为两个部分:第一部分探讨血清外泌体MT1-MMP mRNA的测定方法,研究其在胃癌患者血清中的表达;第二部分研究血清外泌体MT1-MMP mRNA在胃癌中的临床意义,评价其在胃癌早期评估及进展预测中的价值。第一部分:血清外泌体MT1-MMP mRNA的测定及在胃癌中的表达研究目的:探讨血清外泌体MT1-MMP mRNA的测定方法,研究其在胃癌患者血清中的表达。研究方法:1.2016年12月至2017年1月在山东大学齐鲁医院共33例参与者纳入本研究,包括确诊胃癌的患者17例以及来自健康体检中心的健康对照组16例。2.收集所有参与者的空腹血清,提取血清外泌体。对健康对照组和胃癌组分别进行以下观察分析:用透射电镜观察血清中外泌体的形态;用纳米流式检测仪测定外泌体的大小;Western blot分析检测外泌体的标志蛋白CD9、CD63和TSG101。3.提取外泌体RNA,采用qRT-PCR分析外泌体MT1-MMP mRNA的表达。4.分别用RNaseA、Triton X-100+RNaseA处理健康对照组和胃癌组的外泌体,以未予处理作为对照,分析两组MT1-MMP mRNA的表达变化,验证外泌体中MT1-MMP mRNA 的存在。5.以采集2h后的新鲜血清作为对照,研究储存温度和时间的变化对健康对照组和胃癌组血清外泌体MT1-MMP mRNA表达的影响。6.分析胃癌组与健康对照组血清外泌体MT1-MMP mRNA的表达差异。研究结果:1.血清外泌体的特征使用exoEasy Maxi Kit-76064试剂盒(Qiagen,德国)分别从健康对照组和胃癌组血清中提取外泌体。在透射电镜下观察,两组外泌体均呈现出盘状囊泡和双脂层的特异性形态。纳米流式检测仪显示,血清外泌体直径胃癌组90.07±34.85nm,健康对照组91.19±32.84nm。Western blot分析在两组血清外泌体中均检测到外泌体的特异性标志物CD9、CD63和TSG101。2.MT1-MMP mRNA存在于血清外泌体中37℃环境下,与对照(未经处理)相比:仅用RNaseA处理后,胃癌组和健康对照组外泌体MT1-MMP mRNA的表达均无明显变化(P均>0.05);先用Triton X-100穿透外泌体,再用RNase A处理,两组外泌体MT1-MMP mRNA的表达均明显下降(P均<0.001)。外泌体破坏后MT1-MMP mRNA的表达显著下降说明MT1-MMP mRNA确实存在于外泌体中。3.血清外泌体MT1-MMP mRNA的表达不受存储时间和温度的影响与采集2h后的新鲜血清相比:室温、4℃保存12h-24h以及-80℃冻融1-3个循环,健康对照组和胃癌组外泌体MT1-MMP mRNA的表达均无明显变化(P均>0.05)。4.胃癌患者血清外泌体MT1-MMP mRNA的表达显著升高比较胃癌组与健康对照组血清外泌体MT1-MMP mRNA的表达,结果显示胃癌组明显高于健康对照组(P<0.001)。结论:1.血清中外泌体、外泌体RNA的提取和外泌体中MT1-MMP mRNA的测定稳定可靠,血清外泌体MT1-MMP mRNA的表达不受存储时间和温度的影响,具有临床可操作性。2.胃癌患者血清中外泌体MT1-MMP mRNA的表达明显高于健康人群,提示外周血检测血清外泌体MT1-MMP mRNA对于诊断胃癌具有一定潜在价值。第二部分:血清外泌体MT1-MMP mRNA在胃癌中的临床意义研究研究目的:研究血清外泌体MT1-MMP mRNA在胃癌和胃癌前疾病中的表达差异,探讨其在胃癌早期评估中的临床意义;进行血清外泌体MT1-MMP mRNA与胃癌患者临床分期和病理特征的相关性研究,探讨其作为胃癌的生物学标志物的临床价值。研究方法:1.2017年1月至2017年12月在山东大学齐鲁医院共纳入214例参与者:健康对照组31例,慢性萎缩性胃炎组31例,不典型增生组33例,胃癌组119例。健康对照组全部来自健康体检中心,慢性萎缩性胃炎组、不典型增生组和胃癌组均来自住院患者。2.收集所有参与者的空腹血清,按照第一部分的实验方法从血清中提取外泌体、外泌体RNA、采用qRT-PCR分析血清外泌体MT1-MMP mRNA的表达,另外电化学发光法测定血清CEA、CA19-9和CA72-4。3.研究血清外泌体MT1-MMP mRNA在胃癌组、不典型增生组、慢性萎缩性胃炎组、健康对照组的表达差异,探讨其在胃癌早期评估的临床意义。4.研究血清CEA、CA19-9和CA72-4在胃癌组、不典型增生组、慢性萎缩性胃炎组、健康对照组的表达差异。5.研究血清外泌体MT1-MMP mRNA与CEA的相关性,比较其对胃癌的诊断价值。6.胃癌患者收集并记录住院病例信息和临床病理参数,如性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、分化程度、Borrmann分型、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期等。根据UICC/AJCC(2010)临床肿瘤分期标准对胃癌进行TNM分期。进行外泌体MT1-MMP mRNA与胃癌患者常见临床病理特征的相关性研究。另外,对影响胃癌淋巴结转移的可能因素进行logistic回归分析。7.进行外泌体MT1-MMP mRNA与胃癌临床分期的相关性研究,研究血清外泌体MT1-MMP mRNA在胃癌不同TNM分期的表达差异,评价其在胃癌临床进展中的意义。研究结果:1.胃癌组血清外泌体MT1-MMP mRNA的表达显著升高对血清外泌体MT1-MMP mRNA的表达水平进行比较,结果显示:胃癌组明显高于不典型增生组、慢性萎缩性胃炎组和健康对照组(P均<0.05),不典型增生组明显高于慢性萎缩性胃炎组和健康对照组(P均<0.05),慢性萎缩性胃炎组明显高于健康对照组(P<0.05)。2.胃癌组血清CEA的表达明显升高对血清CEA的表达进行比较,结果显示:胃癌组明显高于不典型增生组、慢性萎缩性胃炎组及健康对照组(P均<0.05),不典型增生组、慢性萎缩性胃炎组及健康对照组之间均无明显差异(P均>0.05)。但是,血清CA19-9、CA72-4的表达在胃癌组、不典型增生组、慢性萎缩性胃炎组和健康对照组之间均无明显差异(P均>0.05)。3.血清外泌体MT1-MMP mRNA对胃癌诊断价值优于CEA对胃癌患者血清外泌体MT1-MMP mRNA和CEA进行ROC曲线分析,结果显示:血清外泌体MT1-MMP mRNA的AUC、敏感性及特异性均高于CEA。对MT1-MMP mRNA和CEA联合进行ROC分析显示,两种标志物联合的AUC优于单独。另外,血清外泌体MT1-MMP mRNA与CEA之间无明显相关(P>0.05)。4.血清外泌体MT1-MMP mRNA与胃癌患者临床病理特征相关性研究胃癌患者血清外泌体MT1-MMP mRNA的表达与肿瘤直径、分化程度、Borrmann分型、浸润深度、淋巴结转移、远处转移以及TNM分期均有显著相关(P均<0.05)。多因素logistic回归模型分析显示血清外泌体MT1-MMP mRNA表达升高是淋巴结转移的独立危险因素。5.血清外泌体MT1-MMP mRNA与胃癌患者临床分期相关性研究胃癌患者血清外泌体MT1-MMP mRNA的表达与TNM分期显著相关(P<0.001)。胃癌血清外泌体MT1-MMP mRNA的表达Ⅳ期明显高于Ⅲ期、Ⅱ期和Ⅰ期(P均<0.05),Ⅲ期明显高于Ⅱ期和Ⅰ期(P均<0.05),Ⅱ期明显高于 Ⅰ 期(P<0.05)。结论:1.血清外泌体MT1-MMP mRNA在胃癌中的表达显著升高,胃癌组>不典型增生组>慢性萎缩性胃炎组>健康对照组,对胃癌早期评估有潜在临床意义。2.血清外泌体MT1-MMP mRNA对胃癌诊断价值优于CEA、CA19-9和CA72-4。3.血清外泌体MT1-MMP mRNA表达升高是胃癌淋巴结转移的独立危险因素。4.血清外泌体MT1-MMP mRNA的表达与胃癌患者TNM分期显著相关,Ⅳ期>Ⅲ期>Ⅱ期>Ⅰ期,对胃癌临床分期的评估具有参考价值。由此可见,血清外泌体MT1-MMP mRNA在胃癌早期诊断以及进展预测中具有重要作用,有可能成为胃癌的一种潜在的有效的生物学标志物。