肥胖及代谢综合征（metabolic syndrome,MetS）近年来已成为严重危害人类健康及生命的重大疾病。为了深入研究该疾病的发生机制、筛选可应用的药物靶点及研发高效的诊疗方案,研究人员利用实验动物制备了多种肥胖疾病模型,例如:ob/ob小鼠肥胖模型。ob基因编码产物——瘦素蛋白（Leptin）在肥胖发生及相关并发症的致病机理中,通过调节JAK-STAT等信号通路,在摄食及能量代谢中起非常重要的作用。因此,针对Leptin基因构建了 Leptin缺失型小鼠,ob/ob鼠。ob/ob鼠具有明显的肥胖表型,并被广泛用于肥胖相关机制和临床研究中。但是,由于啮齿类动物与人类的巨大差异,导致此类肥胖模型与人类肥胖相关疾病的表型不一致,并不能很好模拟人类的疾病的发生、发展过程。小型猪在机体构造、遗传同源性、生理生化水平、代谢方式及药代动力学等方面都与人类高度相似,因而已逐渐成为研究人类疾病的模式动物,构建猪模型也成为目前疾病研究的热点。目前,在肥胖疾病研究方面,却少有可遗传的基因编辑猪肥胖模型,而更多的是以饮食诱导为主。基于小型猪的优势和Leptin基因对肥胖及相关疾病的重要影响,本实验室在前期研究中利用ZFN技术制备了 Leptin基因敲除小型猪。本研究在此工作基础上,首先以Leptin双缺失基因型Lep△5bp/△2bp猪和野生型WT-Lep+/+猪作为主要研究对象,对其进行一系列分子和表型检测。结果显示,Lep△5bp/△2bp猪出现了二种新的Leptin转录本,都会导致移码突变和翻译提前终止;ZFN作用没有发生脱靶效应;通过ELISA和针对于特异区段的Western Blot实验验证了 Leptin蛋白的合成和功能在敲除猪中的缺失。由于Lep△5bp/△2bp缺失型个体下丘脑中Leptin介导的JAK2-STAT3信号通路受阻,导致食欲增加,出现明显的峰值体重增长（P<0.001）和体脂率升高（P<0.05）;从12月龄开始,Lep△5bp/△2bp猪出现明显的肥胖症血液生理生化指标的升高（P<0.05）;而且出现明显的以胰岛素抵抗和糖耐受受损为代表性表型的Ⅱ型糖尿病症状。这表明Lep△5bp/△2bp猪具有肥胖及代谢综合征疾病症状,可作为该类疾病研究的动物模型。非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是由肥胖造成肝脏中脂质过度累积而导致的肝脏疾病,是对人类健康危害最大的肥胖并发症之一。人类中的NAFLD病程发展,从最初的非酒精性肝脏脂肪变性,引发非酒精性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis,NASH）,逐渐发展为肝纤维化,进而导致肝硬化,逐级恶化,最终危及生命。Leptin缺乏的啮齿类动物的发病过程只达到第一阶段即脂肪肝阶段便不会继续恶化。因此,目前的啮齿类NASH和肝纤维化模型都是通过药物诱导或者手术的方法获得,与人类NAFLD的发病原因和进程明显不符。故在本研究第二部分探究了 Lep△5bp/△2bp猪的肝损伤表型。H&E和油红O染色结果显示,在12月龄时,Lep△5bp/△2bp猪出现了肝脏脂质过度累积的脂肪肝表型;PAS染色和相关炎性因子基因Q-PCR结果显示,在18月龄时,Lep△5bp/△2bp猪出现NASH表型;纤维化相关特异性染色、标志蛋白的免疫染色及血液学指标结果表明,在25月龄时,Lep△5bp/△2bp猪出现明显的肝纤维化现象,更进一步地分期结果表明其纤维化已经发展到中重度（3.74±0.81）。综合以上结果,Lep△5bp/△2bp猪作为肥胖并发症模型能较完美模拟人类非酒精性肝损伤病程,可用于深入研究该类疾病的发病机制。为了深入探究Lep△5bp/△2bp猪出现Leptin-/-啮齿类动物缺乏的肝纤维化表型的原因,本研究第三部分重点研究了 Lep△5bp/△2bp猪肝纤维化的发生机制。首先本研究对Lep△5bp/△2bp和WT-Lep+/+猪肝脏组织进行转录组测序,并从中筛选得到了148个差异表达基因（Fold Change≥2,FDR<0.05）;GO富集和KEGG富集显示以CYP2E1为代表的6个Ⅱ型p450细胞色素氧化酶基因（CYP2）表达显著上调（P<0.05）;Q-PCR和Western Blot检测也证实了这些基因的表达变化,而此变化与ob/ob小鼠中的表达变化相反;同时发现肝脏、血清中的氧化应激标志物含量显著上升（P<0.05）,结合以上两部分结果,表明在Lep△5bp/△2bp猪肝脏中发生了严重氧化应激反应。结合蛋白网络互作预测和前人研究结果,推断Leptin并不以信号通路方式直接调控CYP2表达。利用Q-PCR和Western Blot实验,发现Lep△5bp/△2bp猪中受到Leptin敲除影响的主要是JAK-STAT和AMPK信号通路。进一步对JAK-STAT和AMPK信号通路相关因子进行蛋白表达检测和组织学免疫荧光检测,结果表明:Leptin缺乏通过下调JAK-STAT通路,从而增强了脂肪ω氧化和β氧化反应;同时通过下调AMPK通路,增强了 Parkin介导的线粒体自噬途径。这二者共同作用,导致氧化应激增强,加剧肝损伤的“二次打击”,使得Lep△5bp/△2bp猪能从脂肪肝恶化成为肝纤维化。在Leptin-/-大鼠中的对比验证实验更进一步地证实了该判断与结论。综上所述,本研究建立了可稳定遗传,并能够较好模拟人类肥胖及相关疾病表征的Leptin-/-猪模型,此模型弥补了目前广泛用于该类研究的ob/ob小鼠模型的不足。利用所构建的Leptin-/-猪模型,深入探究了肥胖引发的肝纤维化发生发展的分子机制,发现Leptin调控的JAK-STAT和AMPK信号通路及下游因子的变化是造成脂肪肝发展为肝纤维化重要原因。本论文的研究结果,不仅为目前的肥胖及肝损伤研究提供了新型的、更接近于人类的疾病模型,更为相关疾病的临床药物筛选和有效诊疗方案的研发提供有利工具。