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目的明确自噬与非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药的相关性,同时阐明调控靶点HMGB1在自噬介导的吉非替尼NSCLC获得性耐药中的关键作用,以及Bcl-2和Beclin-1信号通路与HMGB1及吉非替尼NSCLC获得性耐药的关系。研究方法1.在吉非替尼敏感NSCLC细胞系PC9 (EGFR 19外显子缺失)上,经吉非替尼处理不同时间,构建吉非替尼获得性耐药细胞株PC9-R(EGFR T790M、Met扩增均为阴性)。通过AO染色检测酸性囊泡、Western blot检测耐药过程不同阶段自噬标志蛋白LC3 Ⅰ、Ⅱ、p62 (SQSTM)表达,明确在吉非替尼获得性耐药与自噬的相关性。2.采用小分子RNA干扰技术/脂质体转染技术,构建沉默/过表达HMGB1的PC9细胞,以不同浓度吉非替尼处理后,MTT法检测考察抗肿瘤活性,Western blot检测自噬标志蛋白LC3 Ⅰ/Ⅱ、p62表达,免疫组化法检测LC3 Ⅰ/Ⅱ的分布,明确HMGB1对自噬调控及吉非替尼获得性耐药的影响。3.针对信号转导通路HMGB1/Beclin和MAPK/Bcl2/HMGB1,以Western blot为检测吉非替尼获得性耐药中Beclin-1、Bcl2、pJNK、pERK和p38表达的变化,考察自噬诱导的吉非替尼获得性耐药中]HMGB1与Beclin-1和Bcl2的相互作用和结合情况。结果1.吉非替尼耐药过程中,自噬标志蛋白LC3发生Ⅰ型向Ⅱ型的转化、p62表达下降,表明吉非替尼获得性耐药过程中出现自噬。采用自噬抑制剂氯喹以及RNA干扰阻断技术调控自噬水平,通过MTT法检测发现抑制自噬的发生可以明显增加吉非替尼的抗肿瘤活性,证明自噬介导吉非替尼获得性耐药的发生。2.在构建的吉非替尼获得性耐药细胞株PC9/R中,耐药过程中HMGB1的表达明显上调；沉默HMGB1的表达,吉非替尼的抗肿瘤活性明显增强,表明HMGB1参与吉非替尼获得性耐药的发生。另外,在沉默HMGB1表达后自噬标志蛋白LC3 Ⅰ型向Ⅱ型转变减少、p62的下调被逆转,证明HMGB1通过介导自噬过程发挥调控吉非替尼获得性耐药。3.吉非替尼获得性耐药中Beclin-1以及pBcl2表达上调,Bcl2表达减少；抑制Beclin-1能明显增强吉非替尼的抗肿瘤效果,说明Beclin-1参与吉非替尼获得性耐药的发生。在自噬诱导的吉非替尼获得性耐药中HMGB1与Beclin-1的结合明显增多,促进自噬介导的吉非替尼获得性耐药的发生。结论自噬是吉非替尼NSCLC获得性耐药的重要原因,]HMGB1作为关键靶点介导自噬调控的吉非替尼获得性耐药。而Bcl2/Beclin-1作为重要角色参与了HMGB1介导的吉非替尼获得性耐药。