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目的：人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)与宫颈癌的发生发展关系密切。本研究通过DIPS-PCR (Detection of integrated papillomavirus sequences by ligation-mediated PCR)法检测Siha和Hela细胞中HPV整合位点,以判断该技术能否用于DNA水平HPV整合位点的检测。方法：本研究首先从Siha和Hela细胞系中提取基因组DNA, DIPS法检测Siha和Hela细胞中HPV整合位点,并用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)进行验证结果：通过DIPS-PCR检测Siha和Hela细胞中的HPV整合位点,发现HPV16整合于Siha细胞系13q22.1位点；HPV18整合于Hela细胞系8q24.21位点,与既往文献报道一致。此外,荧光原位杂交的结果验证了Siha细胞系13q22.1位点的整合位点和Hela细胞系8q24.21的整合位点。结论：DIPS-PCR法可在DNA水平检测HPV整合位点,且该检测结果可以由荧光原位杂交所验证。目的：人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16, HPV16)在宿主的整合状态与宫颈癌的发生密切相关。本研究将DIPS-PCR技术应用到临床标本上,以检测HPV16病毒在宿主基因组上的整合位点,为进一步研究HPV潜伏持续感染导致宫颈癌变的分子基础和调控机制奠定理论基础。方法：从宫颈癌临床标本中提取基因组DNA,并进行临床标本HPV分型。用DIPS-PCR技术检测HPV16阳性标本中HPV病毒DNA整合位点,并用NimbleGen目标区域捕获测序进行验证。结果：在125例宫颈癌标本中,发现65例标本呈HPV16阳性。在HPV16阳性的65例临床标本中,有55例标本检测到HPV整合。基中,14例标本整合在3p14位点,8例标本整合在Xp22.1位点,其余标本呈随机整合。取6例有3p14位点整合的标本进行捕获测序,有3例标本验证出3p14位点整合。此外,捕获测序结果表明HPV16对3p14位点的整合可引起宿主基因组的不稳定性。结论：HPV16易整合至人染色体3p14位点及Xp22.1位点,并导致宿主基因的不稳定性,从而可能成为宫颈癌发生的重要诱因之一。目的：由于HPV病毒不能体外培养,目前尚缺乏合适的研究HPV感染与整合的模型。为了进一步研究高危型HPV整合导致正常宫颈上皮细胞发生癌变的具体分子机制,本研究旨在建立锌指核酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)基因组修饰体系。方法：本研究首先针对EGFP基因,设计并构建相应锌指核酶,在细胞外及Siha细胞内破坏EGFP基因；另一方面,本研究通过锌指核酶的切割向Hela细胞基因组中定点敲入EGFP基因。结果：靶向EGFP基因的锌指核酶可在细胞外切割EGFP基因的全长,同时在Siha细胞系内可破坏导入的EGFP基因,致使表达绿色荧光蛋白的细胞比例降低。通过锌指核酶对Hela基因组OCT4基因1号内含子的切割,成功地将EGFP基因定点敲入到该切割位点。结论：锌指核酶技术可在细胞水平定点敲除或敲入靶基因,为深入研究宫颈癌中HPV整合机制奠定良好的基础。