【摘 要】
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目的:通过构建酵母ARS随机突变体库,从中筛选出具有较强的转化效率的ARS序列,用以构建新型高效的克鲁维酵母基因工程载体。方法:针对已知ARS序列设计引物,用含有已知ARS序列
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目的:通过构建酵母ARS随机突变体库,从中筛选出具有较强的转化效率的ARS序列,用以构建新型高效的克鲁维酵母基因工程载体。方法:针对已知ARS序列设计引物,用含有已知ARS序列的质粒pHKBl9UA为模板,利用PCR扩增出ARS片段。再以该ARS片段为模板,进行突变PCR反应,得到ARS随机突变体库。将整个突变体库与酵母的穿梭质粒载体连接,转化大肠杆菌E.coli DH5α进行扩增。抽提大肠杆菌转化子质粒并用限制性内切酶初步鉴定重组质粒。将重组质粒转化宿主克鲁维酵母菌HKY039。同时以不含突变ARS的载体质粒作为对照,比较转化效率。挑取转化效率明显提高的酵母转化子,再抽提酵母菌质粒并转化大肠杆菌。抽提大肠杆菌转化子质粒进行DNA序列测定。把经测序证实有突变的质粒再转化克鲁维酵母菌以进一步验证ARS序列突变与转化效率提高之间的相关性。 结果:成功地构建出适用于筛选ARS序列的随机突变体库,并从中筛选出了具有较强转化效率的新ARS序列,进而成功地构建了新型高效的克鲁维酵母转化载体。 结论:1.首次成功地构建了适用于筛选克鲁维酵母ARS序列的随机突变体库;2.首次利用突变PCR方法成功筛选出具有较强转化效率的克鲁维酵母新ARS序列;3.首次研究了克鲁维酵母ARS序列结构与功能的关系;4.首次成功构建了克鲁维酵母的新型高效转化载
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