DDRT-PCR技术分析甜菜盐胁迫相关基因差

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影响作物产量的因素众多,其中主要问题之一是土壤盐渍化,并且土壤盐渍化目前有明显的严重和扩大趋势。甜菜在全世界很多地区均有种植,是重要的产糖经济作物。相对于其他作物,甜菜具有较好的耐盐碱性。研究甜菜耐盐性,进一步从分子水平上认识甜菜耐盐碱机理,发现并得到更多的甜菜耐盐基因,有利于对于提高栽培甜菜及其他植物的耐盐性、丰富耐盐基因资源意义重大。  本研究以耐盐甜菜品系“O”68为材料,经高盐(300mM浓度NaCl)处理后利用改进的DDRT-PCR技术和银染技术对在正常条件下与高盐条件下甜菜叶片进行不同处理条件下的mRNA差异显示分析,以期找到有价值的耐盐相关基因,并对这些差异表达的cDNA片段进行克隆、测序和功能鉴定。  为得到甜菜高盐诱导表达的基因片段,利用RNA提取试剂盒提取处理组和对照组叶片总RNA,利用琼脂糖凝胶电泳检测完整性并利用分光光度计检测RNA样品的纯度后,反转录合成cDNA,以cDNA为模板,利用26条随机引物与3条锚定引物Oligo(dT)10G(C或A)组合成78对引物组合进行PCR扩增。PCR扩增产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并采取银染法显色。共获得扩增条带一千余条,差异条带50条,其中上调15条,下调35条,选取差异片段回收并进行二次扩增,对回收的片段利用Northern杂交验证,阳性结果进行克隆、测序、NCBI上比对以及同源性分析,本研究共获得12条耐盐相关cDNA片段,涉及叶绿体mRNA及tRNA、SOS信号通路蛋白cDNA、NADH脱氢酶cDNA、硫铁蛋白cDNA等。并由以上结果推测高盐胁迫导致甜菜叶绿体及其相关蛋白转录增强,金属硫蛋白表达增强,盐敏感的信号通路(如SOS)及相关蛋白等在高盐条件下随之表达发生改变。
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