奶牛业是畜牧业非常重要的组成部分之一,其发展水平标志着畜牧业的先进程度。奶牛的产奶性状作为最重要的经济性状,一直是分子育种的研究热点。对奶牛产奶性状的功能基因的挖掘和验证是奶牛分子育种的重要前提和基础,本课题组前期对中国荷斯坦牛群体进行了产奶性状的全基因组关联分析(GWAS)研究,定位到了105个基因组水平的显著SNP位点。本研究在全基因组关联分析研究结果的基础上,选取了分布于牛13条染色体共约6.6Mb的显著区段,运用目标区域捕获技术对60头中国荷斯坦公牛进行高通量混池测序,共得到了该区段内127218个SNP,其中735个位于编码区,418个位于UTR区。通过生物信息学分析及筛选,选取了200个SNP进行深入研究,试验群体来自北京的17个公牛家系以及上海的15个公牛家系共734头母牛,运用飞行质谱技术进行基因分型,利用单标记回归分析混合模型对五个产奶性状进行关联分析,研究共发现40个显著的SNPs,分布于33个基因中,与前期全基因组关联分析一致的基因有17个,同时影响五个产奶性状的基因有7个,分别为DGAT1, HEATR7A, VPS28, CPSF1, PPP1R16A,GPT以2LOC509113。40个显著的SNPs中,35个位于14号染色体,11号和20号染色体上各2个,还有一个位于18号染色体。为了提高统计效力,运用BEAGLE软件对734头母牛的1917个半同胞姐妹进行基因型填充,对合并群体再次进行了关联分析,共得到了66个显著的SNP位点,分布于53个基因中,与第一次关联分析吻合的显著SNPs有38个,吻合的基因有31个。本研究选取了20个关联分析显著的基因,在4头泌乳期中国荷斯坦牛的8个组织(心脏,肝脏,肺脏,肾脏,乳腺,卵巢,子宫,肌肉)中进行了实时荧光定量PCR试验验证,发现有15个基因在mRNA水平上在乳腺组织中的表达量显著高于其他7个组织。在乳腺组织中相对表达量最高的两个基因为核糖体蛋白L8(RPL8)基因以及真核生物延伸因子1D (EEFID)基因,对这两个基因进行进一步的功能验证,western blot试验发现两个基因在蛋白水平上均是在乳腺组织中高表达,与定量PCR试验的结果一致。对EEF11)基因的启动子区CpG岛在5个组织中进行甲基化检测,发现该基因的表达水平和甲基化水平成显著负相关,在乳腺组织中甲基化程度最低。同时针对EEF1D启动子区关联分析显著SNP位点进行启动子活性分析试验,发现野生型的启动子活性显著地高于突变型；对RPL8基因关联分析显著SNP位点进行凝胶阻滞试验,发现突变型探针可以导致转录因子结合的增加。以上试验结果表明,EEF1D以及RPL8基因是影响中国荷斯坦牛产奶性状的潜在关键基因,EEF1D基因在乳腺组织中的表达受DNA甲基化以及5’调控区SNP位点共同调控。