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化学农药的长期大量使用使环境和生态平衡遭到破坏,也威胁到食品安全,而生物农药对人畜安全,不污染环境,有利于农业的可持续发展,是农药产业发展的必然趋势。芽胞杆菌具有抗逆性强,方便制成各种剂型的优点,是生物农药的重要来源。目前萎缩芽胞杆菌主要应用于消毒剂检测和灭菌质量控制方面,而在防治植物病害方面的相关报道还不多。菌株NMB28是从内蒙古土样中分离得到的,通过观察形态特征和生理生化特征,并结合16S r DNA、gyr A、rpo B、ITS的序列分析,将其鉴定为萎缩芽胞杆菌(Bacillus atrophaeus);用平板对峙法和双层培养法测定其抑菌谱,NMB28对多种植物病原真菌和细菌都有抑制作用;离体防效测定结果表明NMB28的发酵液能有效防治番茄灰霉病(Botrytis cinerea);通过透明圈法检测到菌株NMB28能产生嗜铁素、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶和淀粉酶;菌株NMB28能形成较强的生物膜,且产生IAA;NMB28产生的几丁质酶属于诱导型酶,摇培120 h酶活达到最高,且几丁质酶能有效抑制番茄灰霉病菌的生长。菌株NMB28的发酵液进行硫酸铵沉淀得到粗蛋白,通过SDS-PAGE检测到NMB28经几丁质粉诱导产生两种几丁质酶。根据已知萎缩芽胞杆菌的几丁质酶基因序列设计引物,PCR扩增菌株NMB28的几丁质酶基因chit1和chit2,对其序列和编码蛋白的氨基酸序列分析表明,chit1和chit2大小分别为1791 bp和2091 bp,预测蛋白Chit1和Chit2都属于几丁质酶18家族,都有信号肽,存在Glyco-18家族成员共有的典型结构域。chit1和chit2与表达载体p ET-30a(+)连接,成功进行原核表达。Chit1约65 KDa,与预期相符,但天然几丁质酶只有50 KDa左右,推测Chit1在NMB28中存在剪切加工过程。Chit2只表达约80 KDa的包涵体,大小与预期一致,可能是表达载体不合适。Chit1对抑制番茄灰霉病菌的生长作用很小,因Chit2无可溶性表达,无法测定其抑菌活性,推测Chit1可能起辅助作用或是诱导因子。Chit1的最适反应温度为60℃,对高温比较敏感,金属离子铁、铜、钴、锰、钙严重抑制其酶活,钠、镁、EDTA则能提高酶活。菌株NMB28的葡聚糖酶基因大小732 bp,编码糖基水解酶16家族的蛋白,含有信号肽区域和糖基水解酶16家族C端的葡聚糖酶催化结构区域。b Glu连接表达载体p ET-30a(+),原核表达出28 KDa的蛋白,有较高的酶活性,但抑真菌作用较弱。菌株NMB28对大部分抗生素都敏感,可以用卡那霉素筛选质粒p GFP-4412转化菌株NMB28的转化子,通过菌落PCR鉴定出阳性转化子,在荧光显微镜下观察能发出绿色荧光。GFP成功标记菌株NMB28,为研究其在植物上的定殖提供基础。