目的:肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是一种进行性加重的神经系统变性疾病,选择性损害脊髓前角的运动神经元、脑干运动神经核运动神经元及大脑运动皮层的大锥体细胞,表现为进行性加重的肌肉无力、肌肉萎缩、肌束震颤、腱反射亢进,病理征阳性,最终呼吸衰竭死亡。90%～95%的ALS为散发性,5%～10%的ALS为家族性,约20%的家族性ALS与Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD1）基因突变有关。目前该病发病机制尚不清楚,但残存运动神经元中存在泛素阳性包涵体是ALS的重要病理特征之一。泛素是真核细胞中普遍存在且序列高度保守的小分子球形蛋白质,其分子量约8.5K Da,由76个氨基酸残基组成,能够共价结合细胞中的受体蛋白。泛素与泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、去泛素化酶、蛋白酶体及其底物（蛋白质）构成泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）。UPS是细胞内蛋白质降解的主要途径,参与细胞内80%以上蛋白质的降解。大量研究认为UPS在错误折叠蛋白或其他突变蛋白的降解过程中也发挥重要作用。泛素蛋白酶体降解通路失调可导致异常蛋白在细胞内积聚,并进一步引起细胞功能紊乱及变性。UPS功能异常可以发生于UPS途径的任何一个环节,如泛素化过程中泛素量的失衡,泛素结合过程中泛素活化酶E1,泛素结合酶E2,泛素连接酶E3功能失调,蛋白酶体降解水平失调或去泛素化水平失调等。实验表明,在ALS包涵体中所见的泛素连接酶Dorfin能特异性结合并泛素化各种突变的SOD1,对野生型SOD1无影响。过量的Dorfin可减少SOD1包涵体的形成,从而保护神经元免受SOD1毒性的损害。因此,泛素蛋白酶体降解系统和ALS的发病可能存在密切关系。本实验应用家族性肌萎缩侧索硬化动物模型(SOD1^G93A转基因小鼠)观察泛素在ALS病程不同阶段的表达情况,旨在探讨泛素蛋白在ALS的发病中的作用。方法:饲养繁殖家族性肌萎缩侧索硬化动物模型SOD1^G93A转基因小鼠,参考Weydt,P.的描述将SOD1^G93A转基因小鼠分为症状前期（60天）,症状早期,终末期。对照组动物为实验组小鼠同窝非转人突变SOD1基因小鼠。1 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后,心脏灌注4%多聚甲醛固定20min,取小鼠脊髓腰段以4%多聚甲醛固定48h,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,常规组织切片（5μm厚）。5μm厚的石蜡切片应用免疫组织化学SP的方法显示泛素在SOD1^G93A转基因小鼠不同时期脊髓前角细胞的表达分布形式。2 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后,新鲜取小鼠脊髓腰段,液氮速冻,-80℃储藏,提取总蛋白用蛋白免疫印迹的方法检测泛素在SOD1^G93A转基因小鼠不同时期腰段脊髓的表达量的情况。3 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后,新鲜取小鼠脊髓腰段,液氮速冻,-80℃储藏,提取RNA反转录后,扩增目的基因用PCR的方法检测泛素基因在SOD1^G93A转基因小鼠不同时期脊髓前角的转录表达情况。4计量资料用x±s表示,采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计处理。SOD1^G93A转基因小鼠不同时期组与对照组泛素转录mRNA水平及蛋白表达水平的总体比较采用单因素方差分析。P <0.05为差异有统计学意义。结果:1泛素免疫组织化学染色结果显示,对照组小鼠不同年龄阶段腰段脊髓前角神经元均有泛素表达,无明显差别。SOD1^G93A转基因小鼠随病情进展,泛素阳性蛋白表达逐渐聚集,形成泛素阳性聚集体。2 SOD1^G93A转基因小鼠的腰髓总蛋白免疫印迹结果显示,随着病情进展8.5K Da的单泛素及分子量17K Da以上的多聚泛素蛋白水平表达无明显增加（F =0.241,1.972,P>0.05）,无统计学意义。3 SOD1^G93A转基因小鼠的腰髓mRNA反转录后,SOD1^G93A转基因小鼠不同时期组与对照组相比,泛素mRNA-UBA有差异（F =9.938,P<0.05）。症状早期SOD1^G93A转基因小鼠与对照组小鼠相比UBA无明显差异,P =0.08>0.05。症状早期与症状前期SOD1^G93A转基因小鼠相比UBA表达明显增加,有统计学意义,P =0.04<0.05。终末期与症状前期SOD1^G93A转基因小鼠相比UBA表达明显增加,有统计学意义,P =0.01<0.05。SOD1G93A转基因小鼠病情进展过程中,各时期相比及各时期与对照组相比UBB均无明显差异（F=0.637,P=0.612>0.05）,无统计学意义。结论:家族性肌萎缩侧索硬化动物模型SOD1G93A转基因小鼠发病过程中,泛素蛋白聚集形成泛素阳性聚集体,但蛋白单体及形成泛素链的多聚泛素都没有增加,泛素mRNA-UBA基因表达增加,而UBB表达无明显增加,泛素蛋白合成未明显增加,说明蛋白经UPS降解过程中蛋白的泛素化出现异常。